脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中的miRNA差異性表達(dá)的模式分析.pdf

1、目的:
　　本研究課題旨從脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的角度入手,通過應(yīng)用miRNA微列陣及 qRT-PCR對分化過程中差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行篩選及證實,從而對這些miRNA的目的基因和所參與的細(xì)胞信號通路進(jìn)行推測與分析。
　　方法:
　　1對hADSC傳代、培養(yǎng),應(yīng)用ADSC定向血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
　　2對誘導(dǎo)分化前后的ADSC及血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行流式檢測表面抗原標(biāo)記,應(yīng)

2、用顯微光鏡和透射電鏡對誘導(dǎo)前后細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)進(jìn)行觀察,比較,以保證試驗數(shù)據(jù)可靠。
　　3對誘導(dǎo)前的ASDCs及誘導(dǎo)后形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行 miRNA的提取,然后對誘導(dǎo)前后細(xì)胞的差異性表達(dá)miRNA進(jìn)行miRNA微陣列分析
　　4根據(jù) miRNA微列陣的分析結(jié)果,選取誘導(dǎo)前后差異性表達(dá)倍數(shù)較高的miRNA,對其進(jìn)行qRT-PCR驗證,以近一步明確其差異性表達(dá)。
　　5應(yīng)用生物信息學(xué)軟件David6.7對miRNA微列

3、陣篩查出的差異性表達(dá)miRNA進(jìn)行GO、Pathway分析;
　　6通過使用TargetScan,Miranda,PITA,RNAhybrid,及microTar等五個miRNA數(shù)據(jù)庫,對miRNA微列陣和qRT-PCR分析同時篩查出的差異性表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測,選出在三個以上(包括三個)數(shù)據(jù)庫內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)的miRNA的預(yù)測靶基因,整理成表,以供進(jìn)一步分析。
　　結(jié)果:
　　1流式鑒定:
　　誘導(dǎo)前hADS

4、C細(xì)胞CD31、HLA-DR呈陰性表達(dá);CD44、CD105呈陽性表達(dá);誘導(dǎo)后CD44、HLA-DR呈陰性表達(dá),CD31呈陽性表達(dá),CD105呈弱陽性表達(dá)。
　　2光鏡及透射電鏡細(xì)胞組織學(xué)分析:
　　光鏡:細(xì)胞誘導(dǎo)前呈長梭形,渦旋狀排列;誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,梭形變短,大部分細(xì)胞呈橢圓形。
　　電鏡:人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞-誘導(dǎo)前:胞內(nèi)無 W-P小體;人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞-誘導(dǎo)成血管內(nèi)皮細(xì)胞后:胞漿內(nèi)可見血管內(nèi)皮細(xì)胞特

5、有的電子密度較高的W-P小體,胞漿內(nèi)可見血管內(nèi)皮細(xì)胞具有的吞飲小泡。
　　3 miRNA微陣列分析及qRT-PCR驗證:
　　miRNA微列陣:P值〈0.05,30種miRNA在誘導(dǎo)分化前后表達(dá)差異性顯著:其中16種分化后較分化前表達(dá)上調(diào),而14種則表達(dá)下調(diào)。
　　qRT-PCR:從miRNA微列陣的分析結(jié)果中選取6種分化前后差異性表達(dá)倍數(shù)較高的miRNA,驗證出四種顯著的差異性表達(dá)的miRNA,其中包括分化后較分化前

6、表達(dá)上調(diào)的has-miR-29b-3p,has-miR-5096;表達(dá)下調(diào)的has-miR-143-3p,has-miR145-5p。
　　4差異性表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測及pathway分析:
　　差異性表達(dá)miRNA的靶基因所參與的大部分細(xì)胞信號途徑腫瘤細(xì)胞形成的細(xì)胞信號通路相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1 ADSC在定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的過程中存在差異性表達(dá)的miRNA,其差異性表達(dá)方式為上調(diào)或下調(diào)。