重組β防御素3載體的構(gòu)建及其抗菌活性初探.pdf

1、防御素是近年來發(fā)現(xiàn)的人體抵抗病原微生物的重要物質(zhì)—抗菌肽中的一大類，大小約為3-5KDa，是一種富含半胱氨酸的陽離子短肽類物質(zhì)，它在特異性免疫和非特異性免疫中都具有重要的作用，它可以拮抗包括G+菌、G-菌、真菌、病毒、原蟲等在內(nèi)的多種病原體且不易產(chǎn)生耐藥性。
　　現(xiàn)今抗生素的廣泛使用，產(chǎn)生的各種問題，如體內(nèi)藥物的殘留、過敏反應(yīng)、耐藥性，迫使人類急需開發(fā)一種新型抗菌物質(zhì)，因此抗菌肽的研究開發(fā)利用成為一個熱點。防御素是抗菌肽家族中的一

2、大類，為一種含有β-片層結(jié)構(gòu)的陽離子活性肽，人防御素類別中的人β防御素-3（HBD-3）最初是在銀屑病患者的皮損組織提取物中發(fā)現(xiàn)的，且在皮膚、扁桃體、呼吸道、生殖道上皮細胞、成年人骨骼肌、心臟、胸腺、食道、口腔黏膜、氣管和胎盤均有不同程度的表達，HBD-3由于其抗菌譜廣，鹽濃度對其影響相對小，對宿主細胞的毒性低，且對多重耐藥菌有效，因此具有較高的研究價值。
　　本研究根據(jù)大腸桿菌的偏好密碼子，人工設(shè)計并合成了HBD-3基因，克隆到

3、原核表達載體pET30a-SPM-ELP中，獲得重組表達載體pET-30a-ELP-SPM-HBD-3。本實驗所使用的彈性蛋白樣多肽(ELP)介導(dǎo)的原核表達載體系統(tǒng)，是目前最為成功的外源性蛋白表達系統(tǒng)之一。載體中的ELP是一類人工合成的生物大分子，由五肽重復(fù)序列單元VPGXG（Val-Pro-Gly-Xaa-Gly, Xaa可以是除Pro在外的任何一種氨基酸）。ELP具有溫度誘導(dǎo)的可逆變特性，即在高于某一特定相變溫度的溶液中呈現(xiàn)凝聚的狀

4、態(tài)，在低于這一溫度時為可溶的狀態(tài)。ELP融合蛋白也具有與ELP相似的性質(zhì)，因此能通過此特性，用溫度控制和離心法來分離前體蛋白。自我剪接單元(SPM)為一具有自我剪切特性的標(biāo)簽的單元，在有Ca2+存在條件下可執(zhí)行自我剪切功能，可利用鈣離子切割液來切割獲取目的小蛋白。本研究利用其中彈性蛋白樣多肽(ELP)系統(tǒng)具有的溫度誘導(dǎo)反復(fù)相變特性，以低溫誘導(dǎo)法誘導(dǎo)重組菌表達，在不同溫度進行反復(fù)離心洗滌結(jié)合鹽離子的沉淀，獲得了融合蛋白。經(jīng)過SDS-PAG

5、E檢測證明能表達預(yù)期分子量大小的融合前體蛋白ELP-SPM-HBD3，再切割，獲得目的蛋白后，利用瓊脂擴散法來測定其體外抗白念珠菌活性，通過瓊脂擴散法，MIC測定及動物模型來測定其對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。結(jié)果證實本實驗研究中重組表達載體所表達的HBD-3具有一定的抗白色念珠菌及金黃色葡萄球菌活性，其最小抑制金黃色葡萄球菌濃度為80μg/ml，且對金黃色葡萄球菌動物感染模型也有一定的抗感染作用。
　　本實驗方法中重組蛋白的分離、