凋亡抑制基因Livin在食管癌中的表達(dá)及其與P-,53-和Bcl-2表達(dá)、細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)性的研究.pdf

1、本文采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)結(jié)合銀染技術(shù)檢測36例食管癌組織和18例癌旁正常食管組織中LivinamRNA和LivinβmRNA的表達(dá)，并結(jié)合Western blot方法分析Livin蛋白的表達(dá)情況；采用免疫組織化學(xué)方法檢測了36例食管癌組織和18例癌旁正常食管組織中Livin蛋白及P<,53>、Bcl-2蛋白的表達(dá)，并探討L

2、ivin與P53和Bcl-2之間的關(guān)系。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，對食管癌細(xì)胞的增殖活性和凋亡水平進(jìn)行檢測分析，期望證明Livin表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)。 研究材料與方法： 一、實驗材料 標(biāo)本來源于中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院胸外科2005年4月～2005年10月手術(shù)的患者，其中食管癌患者36例，癌旁正常食管組織18例；男性33例，女性3例，年齡41～81歲，平均年齡56.9歲。36例腫瘤組織中，3例低分化，18例中分

3、化，15例高分化，其中食管鱗癌35例，食管腺癌1例，18例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有患者術(shù)前均未行放、化療。 二、實驗方法。 1、逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測Livin基因表達(dá)。取100mg待檢測組織，加入1ml Trizol溶液徹底勻漿。按Trizol試劑盒說明書用一步法提取總RNA，用DNA/RNA測定儀測定RNA濃度和純度。反應(yīng)體系中力口入10×RNA PCR Buffer 1μl、dNTP 1μl、MgCl<,2> 2μl、Rand

4、om 9mers 0.5μl、RNA 1μl、RNase inhibitor 0.25μl、Reverse Transcriptase 0.5μl、ddH<,2>O 3.75μl。反應(yīng)條件：30℃10min，42℃30min，99℃5rain，5℃5min。 Livin基因引物序列為5’-CATGGGTCTCCGTCCTCG-3，(上游)和5’-CAGGGAGCCCACTCTCGT-3’(下游)。在12.5μl反應(yīng)體系中含有滅菌

5、ddH<,2>O7.16μl、20pmol/L上、下游各0.15μl、cDNA2.5μl、Taq Hs 0.04μl、5×Buffer 2.5μl。反應(yīng)條件：95℃ 2min，95℃ 1min，58℃、1min，72℃ 1min，30個循環(huán)：72℃延伸7min。用內(nèi)參照β-肌動蛋白(β-actin)檢測逆轉(zhuǎn)錄效率。PCR產(chǎn)物用8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，100v,1.5h，電泳結(jié)束后，凝膠進(jìn)行銀染。凝膠自動成像儀進(jìn)行攝像分析。應(yīng)用TaKa

6、Ra公司100bp梯度Makers為分子大小對照確定電泳條帶。 2、Western印跡雜交。RIPA buffer 200μl裂解冰凍組織標(biāo)本；采用Folin-酚試劑法進(jìn)行蛋白定量；聚丙烯酰胺凝膠電泳；NC膜(Millipore,USA)轉(zhuǎn)膜2h，加入Livin兔抗人多克隆抗體(1：400，BIOCHEMICALS，USA)和β-actin鼠抗人單克隆抗體(1：400,SIGMA,USA)，室溫孵育2h。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗

7、兔和馬抗鼠單克隆二抗，室溫孵育2h，堿性磷酸酶顯色15min，于自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)下成像，UPV凝膠分析系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)。 3、免疫組化法檢測Livin、P<,53>、Bcl-2蛋白表達(dá)。采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶連接(Streptavidin-peroxidase S-P)免疫組織化學(xué)方法，一抗Livin兔抗人多克隆抗體(美國BIOCHEMICALS公司產(chǎn)品)，工作濃度1：200、P<,53>鼠抗人單克隆即用型抗體、B

8、cl-2鼠抗人單克隆即用型抗體，S-P試劑盒為福州邁新公司產(chǎn)品。實驗步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。將已知陽性胃癌切片為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。胞核、核膜或胞漿染為淡黃至棕黃色者為陽性細(xì)胞標(biāo)志，將陽性細(xì)胞按其數(shù)量及顯色強(qiáng)度分為3級：弱陽性(+)、陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++)。 4、流式細(xì)胞術(shù)檢測食管癌細(xì)胞的增殖活性和凋亡水平。切取深低溫保存的組織塊，網(wǎng)挫方法制備單細(xì)胞懸液，以：PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×10<'6>/ml。

9、一份加PI染色液(PI 5mg，Rnase 2mg，TritonX-1001ml，生理鹽水65ml，枸椽酸鈉100mg，加蒸餾水至100ml)1ml，置4℃冰箱中避光染色30min后上機(jī)分析。另一份中加入FITC-AnnexinV及PI各5μl，室溫下避光靜置15min后上機(jī)分析。 所使用的流式細(xì)胞儀為FACSCalibur型(B．D，USA)。光源為488nm氬離子激光器，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光，每份標(biāo)本計

10、數(shù)10000個細(xì)胞，然后在Macintosh 9.5計算機(jī)上用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)。測量前，以人淋巴細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)品調(diào)校儀器的CT、值在3.0％以內(nèi)。應(yīng)用MetaMorph(cellQuest3.0)細(xì)胞周期分析軟件，計算DNA組方圖各時相分布的百分比，以增殖指數(shù)(proliferationindex，PI)表示增殖活性。二維點陣圖上FITlC高染而PI低染(FITC<'+>PI<'->)者為早期凋亡細(xì)胞，計算其所占的百分比。 三、統(tǒng)

11、計學(xué)分析 計數(shù)資料采用X<'2>檢驗，計量資料采用t檢驗，用SPSS13.0軟件完成。 研究結(jié)果： 1、Livin基因在食管癌組織中的表達(dá)情況Livin基因在36例食管癌組織中表達(dá)陽性率為50.O％(18/36)，而在18例癌旁正常食管組織中低表達(dá)，陽性率為5.6％(1/18)兩者之間差異顯著(P<0.05)，兩種異構(gòu)體基本同時表達(dá)；RT-PCR和Western-blot兩種檢測方法結(jié)果一致。 2、Liv

12、in基因的表達(dá)與食管癌組織臨床病理特征的關(guān)系Livin基因的表達(dá)與食管癌患者的年齡、性別和分化程度無明顯相關(guān)關(guān)系(P>0.05)，而與癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05)。 3、食管癌組織中Livin蛋白表達(dá)與P<,53>Bcl-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性Livin蛋白在36例食管癌組織中表達(dá)陽性率為47.2％(17/36)，而在18例癌旁正常食管組織中低表達(dá)，陽性率為5.6％(1/18)兩者之間差異顯著(P<0.

13、05)。P<,53>蛋白表達(dá)陽性者中，Livin蛋白表達(dá)陽性率52.94％(9/17)、P<,53>蛋白表達(dá)陰性者中，Livin蛋白表達(dá)陽性率為42.11％(8/19)，兩者比較，無顯著性差異(P>0.05)。Bcl-2蛋白表達(dá)陽性者中，Livin蛋白表達(dá)陽性率為64.00％(16/25)，Bcl-2蛋白表達(dá)陰性者中，Livin蛋白表達(dá)陽性率為9.09％(1/11)，兩者比較，差異有顯著性(P<0.01，r=0.452)。 4、

14、食管癌組織Livin基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性36例食管癌組織的細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)平均為(29.27±5.72)％。RT-PCR和Western-blot結(jié)果中，18例食管癌組織Livin表達(dá)陽性，PI為(31.55±6.19)％：18例Livin表達(dá)陰性，PI為(27.00±4.26)％，兩者比較差異有顯著性(t=2.566，P<0.05)。免役組化結(jié)果中，17例食管癌組織Livin蛋白表達(dá)陽性，PI為(32.22±5.66)％

15、；19例Livin蛋白表達(dá)陰性，PI為(26.64±4.43)％，兩者比較差異有極顯著性(t=3.310，p<0.01)。 5、食管癌組織中Livin基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞早期凋亡的相關(guān)性36例食管癌組織的腫瘤細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡率平均為(2,43±0.91)％。RT-PCR和Western-blot結(jié)果中，18例食管癌組織Livin表達(dá)陽性，腫瘤細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡率平均為(2.08±0.95)％；18例Livin表達(dá)陰性，腫瘤細(xì)胞早期細(xì)

16、胞凋亡率平均為(2.78±0.73)％，兩者比較差異有顯著性(t=2.472,P<0.05)。免役組化結(jié)果中，17例食管癌組織Livin蛋白表達(dá)陽性，腫瘤細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡率平均為(1.91±0.63)％；19例Livin蛋白表達(dá)陰性，早期凋亡率為(2.89±0.87)％，兩者比較差異有極顯著性(t=3.837,P<0.01)。 研究結(jié)論： 1、Livin基因在食管癌中高表達(dá)，而在癌旁正常食管組織中低表達(dá)。 2、L