轉人肝細胞生長因子基因的臍帶間質(zhì)干細胞對腦出血后神經(jīng)功能改善的實驗研究.pdf

1、研究目的
　　 1.建立穩(wěn)定、可靠的腦出血模型,為進一步研究腦出血的神經(jīng)功能恢復和治療效果奠定基礎；同時探討腦出血后脫髓鞘病變的病理變化。
　　 2.從人臍索中分離、培養(yǎng)、傳代并鑒定間質(zhì)干細胞,為將來開展干細胞的治療創(chuàng)造條件。
　　 3.運用慢病毒載體將HGF轉染間質(zhì)干細胞,建立高效、穩(wěn)定表達HGF基因的人臍帶來源的間質(zhì)干細胞,為疾病的基因和細胞的聯(lián)合治療打下基礎。
　　 4.觀察HGF轉染的間質(zhì)干細胞和

2、單純間質(zhì)干細胞移植治療腦出血的神經(jīng)功能改善情況,探討HGF和間質(zhì)干細胞發(fā)揮神經(jīng)保護作用的可能機制,為腦出血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的治療手段。
　　 研究方法
　　 1.健康SD雄性大鼠50只,鼠齡約12周,重220克。隨機分為腦出血模型組和假手術組(各20只)、正常大鼠組(10只)共三組。通過注射Ⅳ膠原酶至大鼠內(nèi)囊處誘導腦出血大鼠模型,假手術組注射等量的PBS。運用rotarod test和mNSS功能評分分別于造模

3、型術前1天、術后1、7、14、21、28、35天進行神經(jīng)行為學功能檢測大鼠的神經(jīng)功能損害情況。H&E、luxol fast blue染色、toluidine blue染色和MRI檢測腦組織的病理變化；分別用免疫組織化學染色和Western blot蛋白定量分析檢測髓鞘堿性蛋白(myelin basicprotein,MBP)、髓鞘相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和生長相關蛋白(growt

4、h-associated protein-43,GAP-43),評價腦出血后的病理改變和神經(jīng)纖維的脫髓鞘病變情況。
　　 2.在征得胎兒父母同意后,取產(chǎn)后臍帶用于間質(zhì)干細胞(MSC)的分離和培養(yǎng)。采用酶消化法分離、DMEM中培養(yǎng)間質(zhì)干細胞,并進行傳代。觀察細胞的形態(tài)學,通過流式細胞儀檢測細胞表型鑒定間質(zhì)干細胞。
　　 3.通過慢病毒載體系統(tǒng)(pWPI、pAX2和MD2G)將hHGF基因轉染人臍帶MSC。將hHGF基因克隆

5、至pWPI載體的PMEI酶切位點,再將轉染基因的pWPI和pAX2、MD2G一起感染293T細胞獲得重組慢病毒,再轉染hUCMSC,獲得轉染HGF的間質(zhì)干細胞。熒光顯微鏡下觀察GFP的表達評價轉染效率。Western blotting和ELISA檢測基因轉染后的細胞上清液的hHGF的含量。
　　 4.80只SD雄性大鼠(220g,鼠齡12周),隨機分為HGF.MSC、MSC、PBS和正常組,每組20只大鼠。腦出血模型后7天分別于

6、出血對側腦室在立體定位儀下緩慢注入等容量HGF-MSC、MSC、PBS,含細胞數(shù)為6×105。分別于造模型術前1天、術后1、7、14、21、28、35天進行神經(jīng)行為學功能檢測神經(jīng)功能恢復情況。Luxol fast blue染色觀察腦組織的神經(jīng)纖維改善情況；分別用免疫組織化學染色和Western blot蛋白定量分析檢測MBP、MAG和GAP-43的變化,評價經(jīng)過細胞移植和基因治療后腦出血后的神經(jīng)纖維髓鞘再生情況,探討其對神經(jīng)再生的可能作

7、用機制。
　　 研究結果
　　 1.成功建立腦出血模型,膠原酶誘導腦出血模型后大鼠表現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙。模型建立后,H&E、luxol fast blue染色、toluidine blue染色和MRI檢測發(fā)現(xiàn)腦損傷區(qū)出現(xiàn)脫髓鞘病變等腦出血病理改變。免疫組織化學和Westernbloting檢測發(fā)現(xiàn),MBP和GAP-413的表達在腦出血后較對照組明顯減少,而MAG的表達在出血后升高。
　　 2.從人臍帶成功分離、

8、培養(yǎng)到間質(zhì)干細胞。細胞呈長的扁平的梭形,細胞形態(tài)細長,類似成纖維細胞,具有干細胞的形態(tài)特征。流式細胞儀免疫表型:CD29、CD44、CD90、CD105、CD166陽性表達達96.3％以上,而HLA—DR、CD3、CD16、CD19、CD33、CD34、CD38、CD45和CD133等呈陰性表達,符合間質(zhì)干細胞的表型特征。
　　 3.慢病毒載體系統(tǒng)成功轉染HGF至MSC。熒光顯微鏡下觀察HGF的轉染效率高達80％。Western

9、 blotting和ELASA檢測轉染細胞后上清液的HGF含量顯著高于未轉染基因者,獲得HGF在間質(zhì)干細胞的高效表達和分泌。
　　 4.腦出血模型后hUCMSCs-HGF組的神經(jīng)功能恢復較hUCMSCs和PBS組明顯提高,hUCMSCs-HGF組的神經(jīng)纖維修復達較其它組明顯改善。免疫組織化學和Western bloting結果顯示,轉基因組的MBP和GAP-43的表較其它組表達增強,而MAG表達減弱。
　　 結論

10、　　 1.腦出血后神經(jīng)功能的缺失與腦損傷后脫髓鞘病變有關,MBP、GAP-43和MAG是反映腦出血后神經(jīng)纖維退行性變的敏感標志物,這可以為作為將來的治療觀測指標和靶點。
　　 2.人臍索可成功分離、培養(yǎng)而獲得間質(zhì)干細胞。通過慢病毒載體系統(tǒng)轉HGF基因hUCMSC后可獲得HGF的高效表達和分泌,為神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的治療提供良好條件。
　　 3.本實驗說明ICH神經(jīng)功能的改善與神經(jīng)纖維的修復相一致,提示神經(jīng)纖維是一種新的治療