新型可復(fù)制型廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒DNA疫苗抑瘤活性的初步研究.pdf

1、研究背景:繼預(yù)防性疫苗之后,伴隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的不斷深入發(fā)展,近年來治療性疫苗發(fā)展迅速。通過重新喚起機(jī)體對(duì)靶抗原的免疫應(yīng)答能力,治療性疫苗可以在患病個(gè)體誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答,清除病原體或異常細(xì)胞,使疾病得以治愈。治療性疫苗已經(jīng)成為防治惡性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要技術(shù)手段。由于DNA疫苗具有抗原性特異、應(yīng)用安全及生產(chǎn)便捷的顯著優(yōu)點(diǎn),作為一種特殊的高技術(shù)生物治療藥物,多種類型的DNA疫苗已經(jīng)進(jìn)入了臨床前期及臨床試驗(yàn)。針對(duì)惡性腫

2、瘤治療中的核心難題―免疫耐受‖,基于自主研發(fā)的可復(fù)制型DNA疫苗載體系統(tǒng),本課題組開展了治療性疫苗的免疫增效策略研究,并成功構(gòu)建了新型雙質(zhì)粒可復(fù)制型抗腫瘤DNA疫苗。我們選擇在多種實(shí)體腫瘤中廣泛表達(dá)的兩種腫瘤抗原HCG和Survivin,并選擇與腫瘤血管新生關(guān)系密切的靶點(diǎn)VEGFR2,利用異種化抗原設(shè)計(jì)技術(shù),構(gòu)建了抗腫瘤多靶點(diǎn)異種同源基因復(fù)合抗原,可以有效打破腫瘤對(duì)自身抗原的免疫耐受,激活高效的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng),從而提高腫瘤臨床治

3、愈率。
　　研究目的:在實(shí)驗(yàn)室前期堅(jiān)實(shí)的工作基礎(chǔ)之上,構(gòu)建由CAVA及CAVE組成的可復(fù)制型雙質(zhì)粒DNA疫苗,通過肌肉注射聯(lián)合電脈沖的方法將得到的雙質(zhì)粒疫苗遞送到小鼠體內(nèi),觀察疫苗的抑瘤效果并對(duì)其可能的免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步的探討。
　　方法:
　　1.利用胰蛋白酶灌注消化法分離收集人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells,HUVEC),進(jìn)一步采用腫瘤細(xì)胞HepG2培養(yǎng)上清液誘

4、導(dǎo)HUVEC向腫瘤源性內(nèi)皮細(xì)胞(Tumorderived-EndothelialCells,Td-EC)分化增殖。通過形態(tài)學(xué)觀察和熒光標(biāo)記Ⅷ因子相關(guān)抗原,鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞;利用RT-PCR檢測(cè)Td-EC中腫瘤血管內(nèi)皮標(biāo)志物(TEM)的表達(dá)。
　　2.將小鼠VEGFR2胞外1-4IgG樣區(qū)域(mVEGFR2D1-4)及人β-hcg全長(zhǎng)基因分別克隆到原核表達(dá)載體pET-42a中,將得到的原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)

5、感受態(tài)中并通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá),親和層析法純化融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析,Westernblot鑒定純化后的目的蛋白,ELISA法檢測(cè)純化蛋白的抗原活性。
　　3.利用前期成功構(gòu)建的質(zhì)粒pVAX1-mVEGFR2-GFc-hIL12及可復(fù)制型載體系統(tǒng)PSVK,構(gòu)建以異種化的mVEGFR2D1-4為靶抗原的可復(fù)制型DNA疫苗,命名為CAVE。
　　4.將DNA疫苗CAVE與前期構(gòu)建好的CAVA采用電穿孔肌肉內(nèi)注射的方式免

6、疫小鼠,觀察DNA疫苗的抑瘤效果,并對(duì)其相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步的研究:采用ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清中的特異抗體滴度和血清中的細(xì)胞因子的水平;采用ELISPOT法檢測(cè)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性IFN-γ的分泌;采用海藻酸鹽包裹腫瘤細(xì)胞移植物評(píng)價(jià)抗血管生成情況;對(duì)腫瘤組織進(jìn)行CD31免疫組化染色觀察疫苗免疫后腫瘤毛細(xì)血管密度。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離得到了HUVEC,并將其誘導(dǎo)成為具有良好生物學(xué)活性的具有腫瘤源內(nèi)皮細(xì)胞特

7、性的Td-EC。
　　2.成功誘導(dǎo)并純化出具有良好免疫原性的mVEGFR2D1-4/GST及人β-hcg/GST融合蛋白。
　　3.成功構(gòu)建了可復(fù)制型DNA疫苗CAVE,并通過WesternBlot檢測(cè)證實(shí)了其體外真核表達(dá)。
　　4.觀察聯(lián)合應(yīng)用與單獨(dú)應(yīng)用兩種DNA疫苗免疫后的C57BL/6小鼠移植瘤生長(zhǎng)趨勢(shì),發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比疫苗免疫組小鼠腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制,聯(lián)合應(yīng)用免疫組效果更為顯著。疫苗免疫組小鼠血清內(nèi)可檢測(cè)到特