腺相關病毒介導的OP-1和hVEGF基因轉染阻逆羊退變椎間盤的生物學效應.pdf

1、目的：
　　通過纖維環(huán)16G針頭穿刺的方法建立一種羊椎間盤緩慢退行性變動物模型;觀察腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)載體能否在山羊退變椎間盤體內安全有效的表達;觀察腺相關病毒介導的成骨蛋白-1(osteogenic protein，OP-1)基因體內轉染羊退行性變椎間盤的細胞后有效持續(xù)表達對退變椎間盤的修復效果;觀察腺相關病毒介導的人血管內皮生長因子基因體內轉染能否有效持續(xù)表達并促進退變椎間盤修復

2、;觀察腺相關病毒介導的OP-1基因聯(lián)合hVEGF基因體內轉染羊退行性變椎間盤的細胞后能否有效的持續(xù)表達，并對退變椎間盤的產生更佳的修復效果。
　　方法：
　　1.動物分組:88只清潔級山羊(specific pathogen free，SPF)，抽取4只作為備用動物為H組;A組，8只動物為AAV-OP-1注射組;B組，8只動物為AAV-VEGF注射組;C組，8只動物為AAV-OP-1聯(lián)合AAV-VEGF注射組;D組，8動物為

3、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）注射組（安慰劑，對照組）;E組，4只動物為AAV-EGFP注射;F組，8動物為單純針刺造模組;G組為剩余的8只動物，也做手術，但不損傷椎間盤。即G組和H組的動物椎間盤是完整的。
　　2.制作纖維環(huán)針刺動物模型。排除G組和H組，將剩余的76只動物來做退變動物模型。在全麻下，采取側俯臥位，經(jīng)腹膜外入路顯露椎間盤，任意選相連的3個椎間盤，用16G針頭穿刺纖維環(huán)，穿刺

4、點位于纖維環(huán)中央偏左側平行于下位椎體的上終板并控制其深度為10mm、旋轉180度。用黑色縫在相應椎間盤的橫突作標記。
　　3.動物體內椎間盤基因轉染（A、B、C、D、E組）。時間為造模后第4周（28天）。采用相同的手術入路。A組動物造模間盤用27G針頭的顯微注射器各注射50ulAAV-OP-1(1×1012vg/L);B組動物造模間盤注射50ul AAV2-VEGF(1×1012vg/L);C組造模問盤各注射50ul AAV-OP

5、-1和AAV-VEGF(1×1012vg/L);D組造模間盤各注射50ul PBS;E組造模間盤各注射50 ulAAV-EGFP(1×1012vg/L)。造模后6周(42d)、8周(56d)、12周(84d)、16周(102d)，OP-1、VEGF、雙基因聯(lián)合、空白對照組每組分別殺死4只動物，F(xiàn)、G組每組分別殺死2只動物，取得造模間盤;造模后16周處死E組4只羊，收獲椎間盤組織。
　　4.影像學觀察，分別于0周、4周(28d)、6

6、周(42d)、8周(56d)、12周(84d)、16周(102d)拍攝腰椎正側位DR平片，應用PACS系統(tǒng)做數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
　　5.組織學觀察，采用HE染色、Safranine O染色、Masson染色、免疫組化等方法，定性、定量觀察椎間盤退行性變的發(fā)展變化。
　　6.生物化學檢測，采用免疫熒光、免疫印跡Western-Blot法檢測等定性、定量觀察基因表達的生物學效應。
　　7.統(tǒng)計數(shù)據(jù)。采用SPSS17.0進行統(tǒng)

7、計學分析，單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±SD表示，p＜0.01認為差異有顯著統(tǒng)計學意義，p＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果
　　1.影像學分析結果:OP-1組動物的造模椎間盤高度大于空白對照組，其％DHI與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，雙基因聯(lián)合組的造模椎間盤高度恢復的最佳，其％DHI與空白對照組有顯著差異(P＜0.05)，VEGF組和F組動物的造模椎間盤高度均持續(xù)下降，與空白對照組數(shù)據(jù)相似，其％ DHI與空白對

8、照組數(shù)據(jù)分析，均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.Ⅱ型膠原免疫組化染色:OP-1組動物的造模椎間盤髓核內的Ⅱ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在16周時差異最顯著，其Ⅱ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，OP-1能在動物體內促進Ⅱ型膠原合成代謝。VEGF組與D、F組動物造模椎間盤髓核Ⅱ型膠原含量在各個時期無顯著性差異，VEGF組和F組動物的造模椎間盤Ⅱ

9、型膠原均持續(xù)下降，與空白對照組數(shù)據(jù)相似，其Ⅱ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對照組數(shù)據(jù)分析，均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。雙基因聯(lián)合組動物的造模椎間盤髓核內的Ⅱ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在12和16周時差異最顯著，其Ⅱ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對照組有顯著差異(P＜0.01)，OP-1與VEGF雙基因能顯著提高動物體內Ⅱ型膠原的合成代謝。
　　3.Ⅰ型膠原免疫組化染

10、色:OP-1組動物的造模椎間盤髓核內的Ⅰ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在16周時差異最顯著，其Ⅰ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，OP-1能在動物體內促進Ⅰ型膠原合成代謝。VEGF組與D、F組動物造模椎間盤髓核Ⅰ型膠原含量在各個時期無顯著性差異，VEGF組和F組動物的造模椎間盤Ⅰ型膠原均持續(xù)下降，與空白對照組數(shù)據(jù)相似，其Ⅰ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對

11、照組數(shù)據(jù)分析，均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。雙基因聯(lián)合組動物的造模椎間盤髓核內的Ⅰ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在16周時差異最顯著，其Ⅰ型膠原免疫組化染色的平均光密度值與空白對照組有顯著差異(P＜0.01)，OP-1與VEGF雙基因能顯著提高動物體內Ⅰ型膠原的合成代謝。
　　4.35S測定蛋白多糖合成率:OP-1組動物的造模椎間盤髓核內的蛋白多糖含量在造模6周、8周、12周、16周時高

12、均于空白對照組、F組，在16周時差異最顯著，其35S蛋白多糖合成率與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，OP-1能在動物體內促進蛋白多糖的合成代謝。VEGF組與D、F組動物髓核蛋白多糖含量在各個時期無顯著性差異，VEGF組和F組動物的造模椎間盤蛋白多糖含量均持續(xù)下降，與空白對照組數(shù)據(jù)相似，其35S蛋白多糖合成率與空白對照組數(shù)據(jù)分析，均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。雙基因聯(lián)合組動物的造模椎間盤髓核內的蛋白多糖含量在造模6周、8周、1

13、2周、16周時高均于空白對照組、F組，在12和16周時差異最顯著，其35S蛋白多糖合成率與空白對照組有顯著差異(P＜0.01)，OP-1與VEGF雙基因能顯著提高動物體內蛋白多糖的合成代謝。
　　5.Western Blot法檢測Ⅱ型膠原:OP-1組動物的造模椎間盤髓核內的Ⅱ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在16周時差異最顯著，其Ⅱ型膠原蛋白灰度值與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，OP-1

14、能在動物體內促進Ⅱ型膠原合成代謝。VEGF組與D、F組動物造模椎間盤髓核Ⅱ型膠原含量在各個時期無顯著性差異，VEGF組和F組動物的造模椎間盤Ⅱ型膠原均持續(xù)下降，與空白對照組數(shù)據(jù)相似，其Ⅱ型膠原蛋白灰度值與空白對照組數(shù)據(jù)分析，均無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。雙基因聯(lián)合組動物的造模椎間盤髓核內的Ⅱ型膠原含量在造模6周、8周、12周、16周時高均于空白對照組、F組，在12和16周時差異最顯著，其Ⅱ型膠原蛋白灰度值與空白對照組有顯著差異(P