缺氧影響胃腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞發(fā)生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)第一部分通過體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(spike recovery)來評(píng)價(jià)應(yīng)用密度梯度離心法聯(lián)合CK19細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulationtumor cells，CTCs)富集/鑒定的回收率、特異性及敏感性;第二部分探討微環(huán)境缺氧的變化與胃腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞發(fā)生之間的相關(guān)性。
　　方法:
　　1、應(yīng)用體外培養(yǎng)細(xì)胞加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(spike recovery)來評(píng)價(jià)CTCs富集、鑒定

2、的回收率、特異性及敏感性:即常規(guī)培養(yǎng)人低分化胃腺癌BGC-823細(xì)胞，于顯微鏡下利用無菌PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至100個(gè)/ml，加此細(xì)胞懸液100 ul至10 ml健康志愿者血液中（每份血液含人低分化胃腺癌BGC-823細(xì)胞數(shù)為10個(gè)），采用密度梯度離心法富集CTCs，以抗角化蛋白(CK19)為標(biāo)記物行細(xì)胞免疫熒光鑒定并計(jì)數(shù)CTCs，分別對(duì)健康志愿者及胃癌患者外周血CTCs進(jìn)行富集及鑒定，通過兩組差異來評(píng)價(jià)該方法的回收率、特異性及敏感性。<

3、br>　　2、人低分化胃腺癌BGC-823細(xì)胞經(jīng)不同終濃度CoCl2(0、100、200、300、400 umol/L)處理4h后，應(yīng)用Western Blot檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)表達(dá)水平來篩選最適濃度。
　　3、將60只BALB/C小鼠隨機(jī)分為三組:缺氧組，常氧組、對(duì)照組（生理鹽水），每組20只，采用終濃度200 umol/L CoCl2處理BG

4、C-823細(xì)胞4h組作為缺氧組，無血清培養(yǎng)基處理BGC-823細(xì)胞4h組作為常氧組，鼠尾靜脈注射上述處理胃癌細(xì)胞，注射成功3天后，內(nèi)眥靜脈采血1ml于EDTA抗凝管中，用上述方法進(jìn)行CTCs富集、鑒定及計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1、培養(yǎng)細(xì)胞加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)顯示該方法的平均回收率為75％;10名健康志愿者血液均無CTCs檢出，而20名胃癌患者中，CTCs數(shù)目為0者占所檢測(cè)患者的40％，CTCs數(shù)目大于1個(gè)者占所檢測(cè)患者的60％，即C

5、TCs陽性檢出率為60％。
　　2、BGC-823細(xì)胞經(jīng)終濃度200 umol/L CoCl2模擬缺氧4h后HIF-1α表達(dá)水平最高，與其他不同終濃度處理的細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、CTCs發(fā)生與缺氧明顯相關(guān)，缺氧組小鼠CTCs檢出數(shù)量較常氧組增高(4.70±1.86 vs1.15±0.67, P=0.000)。
　　結(jié)論:
　　1、基于密度梯度離心法、CK19細(xì)胞免疫熒光法的循環(huán)腫