BMSC聯(lián)全pcDNA6-IL-12質(zhì)粒對(duì)小鼠乳腺癌治療作用.pdf

1、目的:制備小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，觀察其在體外對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞（EMT-6）生長(zhǎng)、凋亡及致瘤性的影響;將BMSC聯(lián)合白細(xì)胞介素-12真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA6/IL-12）于乳腺癌荷瘤小鼠瘤體內(nèi)共同注射，探討二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)荷瘤小鼠的治療作用。
　　方法:(1)小鼠BMSC的原代培養(yǎng)及其鑒定:采用差速全骨髓貼壁法培養(yǎng)原代小鼠BMSC，采用形態(tài)學(xué)和成骨誘導(dǎo)茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)法對(duì)其鑒定。(2)制備BMSC條件培養(yǎng)基，分別配置成(

2、25％，50％，75％，100％)四種不同濃度。作用EMT-6細(xì)胞24，48，72 h后，CCK-8法檢測(cè)在不同濃度BMSC條件培養(yǎng)基的作用下，EMT-6細(xì)胞增殖的情況;流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC/7-AAD雙染色法)檢測(cè)在BMSC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下EMT-6細(xì)胞凋亡的情況。(3) BMSC條件培養(yǎng)基處理過(guò)的EMT-6細(xì)胞接種昆明種小鼠，于第4、6、8、10、12、14、16 d測(cè)量腫瘤的大小。第17 d處死小鼠，取出小

3、鼠腫瘤并稱(chēng)重，將腫瘤組織制作成石蠟切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色及病理學(xué)觀察。(4)建立小鼠乳腺癌荷瘤模型，待腫瘤直徑達(dá)到5-8 mm（約4d）將小鼠隨機(jī)分為4組。分別為陰性對(duì)照組（瘤內(nèi)注射PBS）;BMSC組(瘤內(nèi)注射BMSC);IL-12組（瘤內(nèi)注射pcDNA6/IL-12質(zhì)粒）;BMSC聯(lián)合IL-12組（瘤內(nèi)注射BMSC和pcDNA6/IL-12質(zhì)粒）。觀察小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況，每隔兩天測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)短徑，計(jì)算腫瘤的大小。第17d處

4、死小鼠，無(wú)菌條件下剝?nèi)×鲶w和脾臟并稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算脾指數(shù)和抑瘤率。MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的增殖活性，LDH法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的殺傷活性，HE染色觀察腫瘤組織的病理學(xué)改變。
　　結(jié)果:(1)成功培養(yǎng)小鼠BMSC，取P3代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)為陽(yáng)性。(2)隨著B(niǎo)MSC條件培養(yǎng)基濃度的升高以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，EMT-6細(xì)胞的增殖抑制率由（6.8±0.02）％上升到（29.8±0.05）％，凋亡率由（2.3±0.2）％上升到（25

5、.4±0.3）％。(3) BMSC條件培養(yǎng)基處理的EMT-6細(xì)胞致瘤性明顯減弱，腫瘤的體積明顯變小(P＜0.05)。組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織大片壞死。(4) BMSC單獨(dú)應(yīng)用及其與pcDNA6/IL-12聯(lián)合應(yīng)用可導(dǎo)致荷瘤小鼠腫瘤的體積縮小(P＜0.01)，脾淋巴細(xì)胞增生反應(yīng)及殺傷活性增強(qiáng)(P＜0.05)。腫瘤壞死區(qū)擴(kuò)大并且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果顯示BMSC聯(lián)合pcDNA6/IL-12應(yīng)用可顯著提高實(shí)驗(yàn)小鼠抗腫瘤細(xì)胞免疫力，獲