17-demethoxy-reblastatin體外抗乳腺癌細(xì)胞作用及其相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、目的：
　　1.研究17-demethoxy-reblastatin(17-DR)對(duì)人三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer, TNBC)細(xì)胞株MDA-MB-231增殖的影響；
　　2.研究17-DR對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響；
　　3.探討17-DR對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用的相關(guān)分子機(jī)制；
　　4.研究17-DR對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和

2、遷移能力的影響，并探討其作用機(jī)制；
　　5.研究17-DR聯(lián)合順鉑(cisplatin, DDP)對(duì)人TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1. MTT法檢測(cè)不同濃度（0、12.5、25、50、100、200μmol·L-1）17-DR對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖抑制作用；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度17-DR對(duì)乳腺癌細(xì)胞集落克隆形成的影響。
　　2.溴化丙啶（P

3、ropidium Iodide, PI）單染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度17-DR（0、10、50、100μmol·L-1）對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡的影響。
　　3.線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)檢測(cè)不同濃度（0、50、100、200μmol·L-1）17-DR對(duì)乳腺癌細(xì)胞線粒體膜電位的變化。
　　4. Western blot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231經(jīng)不同濃度（0、10、50、100μmol·L-

4、1）17-DR處理后Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP、RIP1以及IκBα蛋白的表達(dá)情況。
　　5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)17-DR對(duì)細(xì)胞遷移的影響、Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　6. Western blot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231經(jīng)不同濃度（0、0.5、5、50μmol·L-1）17-DR處理后基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP-

5、9）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）的表達(dá)情況。
　　7.用MTT法、集落克隆形成法檢測(cè)不同濃度17-DR和/或DDP對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響。
　　8. PI單染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)17-DR和/或DDP作用后細(xì)胞的凋亡情況。
　　9. Western blot檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)50μmol·L-117-DR、8μmol·L-1DDP及5

6、0μmol·L-117-DR與8μmol·L-1DDP聯(lián)用作用后Caspase-3、Bax、Bcl-2及RIP1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.17-DR對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖及凋亡的影響。
　　1.117-DR能抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖，且隨著17-DR濃度的增加和作用時(shí)間的延長增殖抑制作用也不斷增強(qiáng)。MDA-MB-231細(xì)胞作用72 h的IC50為74.9μmol·L-1。50μm

7、ol·L-117-DR作用于細(xì)胞24h、48h、72h的存活率分別為86.8％、76.2%、49.9%。17-DR也能抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231集落克隆的形成。
　　1.2對(duì)實(shí)驗(yàn)中不同因素處理的細(xì)胞按照操作進(jìn)行PI染色，并通過流式細(xì)胞儀分析，觀察17-DR誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用。50μmol·L-117-DR刺激24h，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的凋亡率為14.1%與陰性對(duì)照組0.9%比較有顯著性差異（p<0.0

8、5）。用100μmol·L-117-DR相同條件處理，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的凋亡率增加到22.6%與對(duì)照組比較有顯著性差異（p<0.05）。
　　1.3經(jīng)17-DR處理的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行JC-1染色，并通過流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示17-DR也產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。
　　2.細(xì)胞經(jīng)17-DR處理后凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3和 PARP)以及RIP1、IκBα蛋白的表達(dá)情況。

9、
　　17-DR能增強(qiáng)Bax蛋白的表達(dá)且能誘導(dǎo)caspase底物 PARP蛋白的激活并產(chǎn)生了裂解，同時(shí)使Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。隨著17-DR濃度的增加，RIP1蛋白表達(dá)下調(diào)，而原型抑制因子IκBα表達(dá)則沒有減弱。
　　3.17-DR對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響及其作用機(jī)制。
　　17-DR能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移，高濃度17-DR對(duì)細(xì)胞遷移能力的抑制作用更明顯。Transwell細(xì)胞遷

10、移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示17-DR低、中、高濃度（依次為0.5,5,50μmol·L-1），隨藥物濃度增加對(duì)細(xì)胞的遷移抑制率也逐漸增加，分別為38.6%、57.7%、68.3%。同時(shí)Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)也顯示17-DR隨著濃度的增加對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制率也隨之增加，分別為38.1%、59.0%、77.1%。17-DR能下調(diào)熱休克蛋白90(heat shock protein90, Hsp90)顧客蛋白MMP-9的表達(dá)，同時(shí)使TIMP-1蛋白

11、表達(dá)上調(diào)。
　　4.17-DR聯(lián)合DDP對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。不同濃度17-DR或 DDP對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用，且二者聯(lián)用時(shí)抑制作用增強(qiáng)。50μmol·L-117-DR、8μmol·L-1 DDP及二者聯(lián)用刺激24h誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率依次為14.7%、20.1%、45.2%。聯(lián)合用藥組Caspase-3的激活增強(qiáng)以及下調(diào)RIP1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.17-DR對(duì)人乳腺癌細(xì)胞

12、MDA-MB-231具有增殖抑制作用，且隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞存活率逐漸降低。
　　2.17-DR能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能通過下調(diào)Hsp90的顧客蛋白R(shí)IP1，增加促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并且激活了促凋亡相關(guān)的PARP蛋白。
　　3.17-DR具有抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用，其機(jī)制可能通過下調(diào)MMP-9，同時(shí)增加TIMP-1蛋白的表達(dá)來發(fā)揮作