異硫代氰酸酯抗癌活性及MTBITC誘導A549細凋亡機理的研究.pdf

1、近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內呈不斷上升趨勢，其中80％-85％表現(xiàn)為非小細胞肺癌。流行病學研究表明，十字花科蔬菜的攝入可降低癌癥的患病率，其最有效成分為硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷)的降解產物-異硫代氰酸酯(ITCs)。目前，對十字花科蔬菜中ITCs的研究主要集中在組分分析及含量的測定，而對其單體的分離研究較少；ITCs的結構與活性之間的關系尚不明確；其誘導腫瘤凋亡機制尚未見詳盡報道。萊菔素(MTBITC)誘導人非小細胞肺癌A54

2、9細胞凋亡的信號轉導途徑及作用機理的研究尚未見報道。
　　 本論文以分離得到的5個ITCs為研究對象，對其體外抗腫瘤活性進行了藥效學評價，并從量子化學角度分析了其結構與活性的關系。并以人非小細胞肺癌A549細胞為靶細胞，研究了MTBITC誘導A549細胞凋亡的機理。主要研究結論如下：
　　 1、為優(yōu)化硫苷的酶解條件，以一點紅蘿卜種子為研究對象，MTBITC得率為指標，采用響應面法優(yōu)化確定最佳酶解條件為：酶解溫度25℃，酶

3、解時間8h,Vc添加量0.06mg/g，酶解pH值為3.71。MTBITC的實際得率為3.53mg/g。
　　 2、采用丙酮提取，利用多種現(xiàn)代色譜技術(硅膠柱層析，Sephadex LH-20凝膠色譜，高效液相制備等)從一點紅蘿卜、澄海粗條芥藍、牛心甘藍、西蘭花種子中分離得到了5個ITCs，分別鑒定為萊菔素(MTBITC)(Ⅰ)、3-(甲硫基)丙基異硫代氰酸酯(Iberverin)(Ⅱ)、蘿卜硫素(Sulforaphane)(Ⅲ

4、)、3-(甲磺酰基)丙基異硫代氰酸酯(Iberin)(Ⅳ)和3-丁烯基異硫代氰酸酯(3-BITC)(Ⅴ)。
　　 3、對5個ITCs體外抗腫瘤活性的藥效學評價表明，MTBITC、Sulforaphane和Iberin對人肺癌A549和LAC、人肝癌HepG2、人宮頸癌HELA細胞均有明顯的抑制作用。A549細胞對MTBITC的敏感性最強；MTBITC, Sulforaphane和Iberin對HepG2、LAC和HELA細胞的抑

5、制作用相似，但明顯強于Iberverin和3-BITC。
　　 4、基于DMol3模塊，從量子化學角度對5個ITCs進行幾何構型優(yōu)化，在此結構基礎上進行Mulliken電荷分布及前線軌道能量計算，分析了ITCs的活性位點，及其抗癌活性與電子結構的關系。結果表明，ITCs的特征基團N=C=S中間C原子作為親電位點，側鏈上的磺?；土蚧鶠檩o助位點，使其具有一定的抗癌活性。ITCs的抗癌活性差異與ITCs分子的負電荷分布、前線分子軌道

6、的離域性及最低未占據軌道能量和最高占據軌道能量的差值(△EL-H)有關。
　　 5、MTBITC以劑量-時間依賴性抑制A549細胞增殖，其抑制腫瘤細胞增殖主要通過誘導細胞凋亡，而非壞死。形態(tài)學研究，發(fā)現(xiàn)MTBITC使A549細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)；PI單染和AnnexinV/PI雙染流式細胞術分析，表明A549細胞經MTBITC處理后出現(xiàn)明顯的凋亡峰，細胞周期阻滯于S期和G2/M期，細胞以早期凋亡為主，呈劑量依賴性。分子對接研究

7、表明，MTBITC與微管蛋白疏水區(qū)域內部的Cys347殘基以共價鍵結合，與Lys352殘基以氫鍵結合，說明MTBITC通過影響微管蛋白的價鍵，阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡。
　　 6、采用RT-PCR法、流式細胞術、Caspase分光光度檢測法等，分析凋亡過程中相關基因mRNA表達情況，檢測線粒體膜電位(ΔΨm)、活性氧(ROS)、Ca2+濃度及Caspase-3、-8、-9的變化，探討MTBITC誘導A549細胞凋亡的機理。結果

8、顯示，MTBITC使△Ψm降低，細胞內游離的ROS和Ca2+濃度含量升高，Bcl-2、Bcl-xL的mRNA表達下調，Bax和Bid mRNA表達上調，Caspase-9被激活，且具有時間依賴性，說明線粒體途徑和Bcl-2基因家族參與了MTBITC誘導A549細胞凋亡的調控。同時，MTBITC使細胞Fas、FasL、FADD mRNA表達增強，Caspase-8，-3活性升高，且具有時間依賴性，表明MTBITC通過Fas途徑引起A549