作物秸稈栽培的黑木耳子實(shí)體耐旱機(jī)制.pdf

1、隨著國家天然林保護(hù)的實(shí)施和停伐范圍的不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致木屑資源市場供應(yīng)不斷減少，嚴(yán)重地制約了黑木耳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。另一方面，國家又是作物秸稈大國，秸稈資源極為豐富。然而作物秸稈隨意丟棄或就地焚燒的現(xiàn)象隨處可見，既浪費(fèi)了資源，又污染了環(huán)境。因此，作物秸稈完全或部分替代木屑栽培黑木耳受到廣泛關(guān)注，而且栽培后的廢料可作為有機(jī)肥提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，大力發(fā)展作物秸稈栽培黑木耳對促進(jìn)作物產(chǎn)業(yè)和黑木耳產(chǎn)業(yè)具有良好的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會效益，也對生

2、態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展以及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要的意義。
　　在黑木耳栽培過程中，干旱是影響產(chǎn)量最大的環(huán)境脅迫因子。對于一般生物（絕大數(shù)陸生植物和蕈菌）營養(yǎng)體來說，干旱脅迫嚴(yán)重時可使其干枯、死亡，即使解除了干旱脅迫，也很難恢復(fù)其生命特征。然而黑木耳（Auricularia auricula）子實(shí)體在干旱脅迫下，雖然干燥但卻并未死亡，當(dāng)環(huán)境條件合適時可以吸水繼續(xù)生長。由此可見，與其他生物營養(yǎng)體相比，黑木耳子實(shí)體極強(qiáng)的耐旱性。在干旱脅迫

3、下，黑木耳子實(shí)體這種很強(qiáng)的生存能力、獨(dú)特的生存方式及生命現(xiàn)象在真核生物界非常罕見。目前，還未見黑木耳耐旱機(jī)制研究相關(guān)報道。
　　基于這一研究背景，利用作物秸稈栽培黑木耳（配方:木屑30％、豆秸43％、玉米芯10％、麥麩15％、石膏1％和石灰1％）。待耳片長至直徑2cm左右采摘后在陽光下自然干燥，當(dāng)失水率達(dá)到0％（對照）、10％、30％、50％和70％時，收集樣品作為試驗(yàn)材料，在生理學(xué)和分子生物學(xué)水平上研究黑木耳子實(shí)體的耐旱機(jī)制。本

4、研究成果對理解生命在干旱條件中生命的生存方式及其現(xiàn)象的多樣性，豐富生物耐旱理論具有重要的科學(xué)價值和意義;為黑木耳子實(shí)體抗逆性研究提供了依據(jù)和參考;為黑木耳子實(shí)體分子生物學(xué)深入研究提供了豐富的基因資源;也為黑木耳基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。研究內(nèi)容和主要研究結(jié)果如下:
　　1.干旱脅迫對黑木耳子實(shí)體的傷害
　　與對照相比，丙二醛(MDA)含量和細(xì)胞膜透性在失水過程中差異不顯著，表明黑木耳子實(shí)體在干旱脅迫條件下沒有受到傷害。

5、　　2.黑木耳子實(shí)體耐旱的生理機(jī)制
　　(1)滲透調(diào)節(jié)作用:可溶性蛋白含量在失水過程中(10％～70％)急劇升高;而可溶性糖、可溶性多糖和可溶性氨基酸含量在失水率50％和70％大幅增加。這些物質(zhì)均能在干旱脅迫條件下發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)作用，以保護(hù)黑木耳子實(shí)體。其中可溶性蛋白滲透調(diào)節(jié)能力最強(qiáng)。
　　(2)抗氧化系統(tǒng):超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)在失水過程中(10％～70％)酶活力大幅提高，是清除

6、氧自由基(ROS)的第一道防線;抗壞血酸(AsA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量在失水率50％和70％升高，脯氨酸含量僅在失水率70％時升高，構(gòu)成了清除ROS第二道防線?？寡趸到y(tǒng)這二道防線能有效地清除干旱脅迫誘導(dǎo)的過量ROS，保護(hù)黑木耳子實(shí)體免受氧化傷害。
　　(3)呼吸酶:蘋果酸脫氫酶(MDH)酶活力在失水過程中(10％～70％)急劇下降，在失水率50％和70％降至零，表明干旱脅迫抑制三羧酸循環(huán)(TCA);葡萄糖-6-磷酸脫氫

7、酶(G-6-PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-PGDH)聯(lián)合酶活力在失水過程中（10％～70％）持續(xù)升高，說明磷酸戊糖途徑(PPP)是黑木耳子實(shí)體在干旱脅迫下主要呼吸途徑，可提供大量NADPH用于清除 ROS和代謝。
　　(4)黑色素:黑色素含量失水率在30％～70％持續(xù)增加，有利于吸收紫外線和清除ROS，為黑木耳子實(shí)體在干旱脅迫和光脅迫中提供保護(hù)。
　　3.黑木耳子實(shí)體耐旱的分子機(jī)制
　　失水率為0％的黑木耳子實(shí)

8、體為對照(C)，失水率為30％、50％和70％的黑木耳子實(shí)體等量混合物為處理(T)，采用SMART策略構(gòu)建了cDNA抑制性消減雜交(Suppression SubtractiveHybridization，SSH)文庫。正向庫(T+C):Tester為T的cDNA，Driver為C的cDNA;反向庫(C+T):Tester為C的cDNA，Driver為T的cDNA。
　　(1)測序結(jié)果:兩個文庫的所有克隆測序后，序列經(jīng)過去載體和接

9、頭、聚類和拼接獲得305個表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)，其中正向庫146個，反向庫159個。
　　(2)同源性比對:在NCBI數(shù)據(jù)庫，用Blastx對所有ESTs進(jìn)行同源性比對，得到96個同源性高且蛋白質(zhì)功能明確的ESTs（正向庫39個，反向庫57個），209個同源性較高但蛋白質(zhì)功能為推測的ESTs（正向庫107個，反向庫102個），80個未查到或同源性較低的ESTs（正向庫47個，反向庫33個）。
　　(3)差異表達(dá)基因:根據(jù)

10、ESTs編碼蛋白質(zhì)的信息，將96個蛋白質(zhì)功能明確的ESTs分為9個類別。差異ESTs分析結(jié)果表明在干旱脅迫過程中，黑木耳子實(shí)體通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變換，開啟防御系統(tǒng)增強(qiáng)耐旱能力。差異表達(dá)基因功能分類及耐旱ESTs的作用如下:
　　1)碳水化合物代謝:纖維素酶、巖藻糖酶、木糖苷酶與阿拉伯呋喃糖苷酶上調(diào)表達(dá)（正向庫ESTs）可將纖維素、半纖維素等多糖類物質(zhì)分解為可溶性糖;葡聚糖磷酸化酶、β-葡聚糖合成酶和CoA合成酶上調(diào)表達(dá)促進(jìn)了可溶性

11、多糖合成?？扇苄蕴呛涂扇苄远嗵呛刻岣?，可增強(qiáng)黑木耳在干旱脅迫時的滲透保護(hù)作用。
　　2)蛋白質(zhì)代謝:翻譯起始因子eIF2和肽基脯氨酰異構(gòu)酶上調(diào)表達(dá)，可增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成;脯氨酰肽酶、絲氨酸羧肽酶、真菌酸性蛋白酶、肌酸酶/氨基肽酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶以及泛素支架蛋白Cullin下調(diào)表達(dá)（反向庫ESTs）降低了蛋白質(zhì)分解速度。蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)、分解下降，有利于積累蛋白質(zhì)，可提高黑木耳在干旱脅迫時的滲透保護(hù)作用和增強(qiáng)耐早相關(guān)蛋白

12、的合成。
　　3)氨基酸代謝:鄰氨基苯甲酸合成酶和谷氨酰胺水解酶上調(diào)表達(dá)可促進(jìn)色氨酸和谷氨酸合成，金屬依賴性肽酶和26S蛋白酶體的硫氧還蛋白域上調(diào)表達(dá)也可通過蛋白質(zhì)分解增加氨基酸含量。氨基酸含量增加，可為黑木耳在干旱脅迫下增強(qiáng)滲透保護(hù)作用。
　　4) DNA穩(wěn)定相關(guān):ⅡB型拓?fù)洚悩?gòu)酶、錯配堿基對和十字形DNA識別蛋白、3-磷酸多核苷酸激酶上調(diào)表達(dá)，增強(qiáng)了DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的解旋和恢復(fù)能力;染色體分離ATP酶上調(diào)表達(dá)，可增加染色

13、體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和促進(jìn)染色體分離。
　　5)轉(zhuǎn)錄相關(guān):DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶Ⅰ上調(diào)表達(dá)，可促進(jìn)核糖體rRNA轉(zhuǎn)錄，有利于蛋白質(zhì)合成;RNA依賴的RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、沉默信息調(diào)節(jié)因子2、RNA解旋酶的下調(diào)表達(dá)，可控制黑木耳子實(shí)體某些特定基因在干旱脅迫下的表達(dá)和沉默。
　　6)信號轉(zhuǎn)導(dǎo):促分裂原活化蛋白激酶、RCK1蛋白激酶上調(diào)表達(dá)以及WD40重復(fù)蛋白下調(diào)表達(dá)，可提高清除ROS能力和增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)作用;CDK細(xì)胞周期蛋白依

14、賴性激酶A上調(diào)表達(dá)，可加速黑木耳子實(shí)體休眠進(jìn)程。
　　7)胞內(nèi)胞外運(yùn)輸:網(wǎng)格銜接蛋白復(fù)合物σ亞基APS2、胞外分泌復(fù)合體Sec10亞基、主要促進(jìn)超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及氯離子通道蛋白上調(diào)表達(dá)，可促進(jìn)蛋白質(zhì)、小分子物質(zhì)和無機(jī)離子等的分泌和運(yùn)輸，以增強(qiáng)黑木耳子實(shí)體耐旱性。
　　8)能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換:細(xì)胞色素C氧化酶亞單位1上調(diào)表達(dá)，可促進(jìn)電子傳遞鏈ATP合成;GSH依賴的甲醛脫氫酶、Zn依賴的乙醇脫氫酶、FAD依賴的脫氫酶和Aldo-酮還

15、原酶上調(diào)表達(dá)，可促進(jìn)還原力合成，參與清除ROS及有毒物質(zhì)。
　　9)細(xì)胞防御:細(xì)胞色素P450、芳香胺N-乙?；D(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶和腈水解酶上調(diào)表達(dá)，有利于清除體內(nèi)外的毒素;乳酰谷胱甘肽水解酶和過氧化物酶體合成因子1上調(diào)表達(dá)，不僅提高GSH、AsA和VE含量和SOD、CAT和POD等酶活力以清除ROS等自由基和毒素，還可加快生物氧化進(jìn)程;CRISPR/CAS系統(tǒng)上調(diào)表達(dá)，可防止外源生物及其DNA入侵;熱激蛋白70上調(diào)表達(dá)，有利于蛋白