RIG-Ⅰ在機體免疫反應中的作用及其機制初步研究.pdf

1、RIG-I(Retinoic acid-inducible gene I)是全反式維甲酸ATRA (all trans-retinoicacid)誘導NB4細胞分化過程中克隆到的一個上調基因,在抗病毒反應中起重要作用.本實驗室構建了RIG-I基因剔除小鼠模型,并對其進行表型分析,發(fā)現該基因與T淋巴細胞自穩(wěn)狀態(tài)維持和免疫球蛋白類別轉換相關和野生型小鼠相比,隨年齡的增加,RIG-I基因剔除小鼠體重逐漸減輕,到3個月時出現顯著性差異；對其各組

2、織器官進行病理分析,結果顯示RIG-I基因剔除小鼠的胃腸出現不同程度的炎癥細胞侵潤,統(tǒng)計學顯示3月齡的RIG-I基因剔除小鼠均出現巨大肥厚性胃炎,2月齡的RIG-I基因剔除小鼠70﹪出現自發(fā)性腸炎樣癥狀,并隨著年齡增加侵潤程度逐步增加；菌群分析顯示RIG-I基因剔除小鼠腸道粘膜菌群改變；RIG-I基因剔除小鼠小腸的淋巴器官Peyer's Patch的數目顯著減少、體積顯著減??；TUNEL和流式分析結果顯示RIG-I基因剔除小鼠的Peye

3、r's Patch 細胞凋亡增加,但OVA(卵清白蛋白)免疫后Peyer's Patch生發(fā)中心正常形成；RIG-I基因剔除小鼠比野生型小鼠對DSS(Dextran sulfate sodium salt)易感性顯著性增加.以上結果提示RIG-I基因剔除小鼠存在顯著的免疫缺陷癥狀,本實驗對與機體炎癥反應關系密切的T細胞做進一步的研究。 利用EUSA進一步分析RIG-I基因剔除小鼠免疫系統(tǒng)各個細胞類型功能學變化.檢測 RIG-I

4、基因剔除小鼠和野生型小鼠的脾臟細胞體外培養(yǎng)的上清,基礎狀態(tài)下,RIG-I基因剔除小鼠脾臟細胞IFN-γ吖分泌比野生型小鼠高2.5倍,IL-10沒有顯著性變化；PMA體外刺激培養(yǎng)三天后,RIG-I基因剔除小鼠脾臟細胞IFN-γ分泌比野生型小鼠高14倍,LPS刺激下IL-10分泌也顯著增加,IL-4未見顯著性改變,表明RIG-I基因剔除小鼠的脾臟細胞因子分泌發(fā)生改變；RIG-I基因剔除小鼠的T細胞亞群流式分析結果表明RIG-I基因缺失沒有影

5、響T細胞在胸腺中的發(fā)育；脾臟總的CD4+、CD8+的T細胞數量和比例未見顯著性改變,但RIG-I基因剔除小鼠中CD4+T細胞中初始T細胞(CD44<'low>CD62L<'high>)細胞比例明顯降低,CD44<'low>CD62L<'low>T細胞、效應性T細胞(CD44<'high>CD62L<'loW>)、記憶性T細胞(CD44<'high>CD62L<'high>)顯著性增加；CD8+T細胞中初始T細胞(CD44<'low>CD

6、62L<'high>)比例顯著性降低,效應性T細胞CD44<'high>CD62L<'loW>)比例比野生型小鼠也有顯著性升高,而雙陽性和雙陰性細胞沒有顯著性變化；TUNEL和流式結果顯示脾臟T細胞凋亡增加；胸腺和脾臟調節(jié)性T細胞在數目和比例上沒有顯著性差異,但是體外抑制實驗表明RIG-.,基因剔除小鼠脾臟調節(jié)性T細胞CD4+CD25+功能缺陷. Gai2(G pretein αinhibitory subunit)是G蛋白家族

7、的成員之一,Gai2基因剔除小鼠和.RIG-I基因剔除小鼠表型有很大的相似性,提示RIG-I和Gai2之間的相關性.RIG-I基因剔除小鼠各組織器官中Gai2有不同程度的表達降低；NB4細胞中,隨著ATRA誘導RIG-I基因的表達增加,Gai2亦出現相應的表達增加；Luciferase實驗也表明.RIG-I對Gai2的啟動子區(qū)域有正向的轉錄調控作用.同時Luciferase實驗也提示RIG-I負向調控Blimp-I(B lymphocy

8、te induced maturation protein-1)啟動子的轉錄.以上結果提示.RIG-I可能通過調節(jié)Gai2和Blimp-1的轉錄,改變T細胞在外周的免疫自穩(wěn)狀態(tài),從而導致.RIG-I基因剔除小鼠胃腸炎的發(fā)生. 前期工作表明.RIG-I基因剔除小鼠免疫球蛋白類別轉換出現異常,本研究建立了RIG-I高表達B細胞株1B4.B6/pcDNA3.1-RIG-I,以期進一步闡明RIG-I在免疫球蛋白類別轉換中的作用及其分子機

9、制. 用LPS刺激1:B4.B6/pcDNA3/1-RIG-I和對照細胞株184.B6/pcDNA3.1不同的時間段,并對各種免疫球蛋白的胚系轉錄本和類別轉換后轉錄本進行了檢測.結果表明刺激前后IgM:胚系轉錄本在兩種細胞株中沒有顯著差異,在RIG-I高表達的細胞株中IgGl、IgG3胚系轉錄本增強,IgG3類別轉換后轉錄本顯著性增強；p50在IgG3類別轉化事件中起關鍵性作用,檢測結果顯示和對照細胞株相比,184.B6/pcD

10、NA3.1-RIG-I細胞中p50蛋白水平增強,提示RIG-I對p50蛋白水平有調節(jié)作用；免疫共沉淀顯示RIG-I蛋白和p50蛋白之間存在相互作用；RIG-I主要定位在細胞質中,EGFP示蹤實驗發(fā)現RIG-I也存在細胞核中；RIG-I過表達使1B4.B6細胞中CD138單陽性細胞的比例降低,但CD138+細胞中分泌IgG3的細胞比例顯著增加；MTT結果顯示RIG-I抑制1B4.B6細胞的增殖；流式結果同樣顯示RIG-I基因高表達改變細胞

11、生長周期.本部分研究顯示RIG-I高表達上調p50蛋白水平并和其相互作用促進免疫球蛋白IgG3類別轉換事件的發(fā)生.同時顯示RIG-I高表達增強B細胞分泌IgG3的能力不是通過加快細胞增殖來完成的. 進一步對RIG-I基因剔除小鼠骨髓細胞基因芯片結果分析表明.RIG-I基因的缺失引起免疫防御、細胞周期、免疫球蛋白類別轉換、物質代謝等方面基因的轉錄改變,對RIG-I基因剔除小鼠的相應表型可以做一定的解釋. 本研究首次報道RI