柑桔衰退病毒p25、p27和p20基因的克隆及生物信息學(xué)分析.pdf

1、柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)是一種具有經(jīng)濟(jì)重要性的病害，廣泛分布于世界各柑桔產(chǎn)區(qū)，對世界柑桔產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重威脅。CTV主要通過嫁接和蚜蟲傳播流行，褐色桔蚜(Toxoptera citricida)是強(qiáng)力媒介昆蟲。CTV屬于長線形病毒(Closterovirus)，基因組為19，296個核苷酸組成的正義單鏈RNA，是目前已知植物病毒基因組中最大的病毒，具有12個開放閱讀區(qū)(ORF1a、ORF1b、OR

2、F2～ORF11)，其中ORF7和ORF6編碼主要衣殼蛋白p25和次要衣殼蛋白p27，ORF10編碼疏水性蛋白p20。這三個蛋白有可能在褐色桔蚜傳播CTV中發(fā)揮重要作用，并且p25被認(rèn)為與CTV致病性有關(guān)，為了更多了解這三個基因及其蛋白的信息，本研究應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增，克隆上述三個基因全長，應(yīng)用生物信息軟件和生物信息網(wǎng)站分析其堿基組成，建立其系統(tǒng)進(jìn)化樹，預(yù)測其蛋白的等電點(diǎn)、二級結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)，為進(jìn)一步進(jìn)行基因原

3、核表達(dá)蛋白，制備CTV編碼蛋白特異性抗體，深入進(jìn)行桔蚜傳播CTV及其致病機(jī)理研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 1.構(gòu)建了三個基因的克隆載體CTV-p25、CTV-p27和CTV-p20 以帶有CT11的核酸粗提物為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得p25、p27、p20全長ORF，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接到克隆載pTA-2上，轉(zhuǎn)化E.coli菌株DH5a，利用氨芐青霉素抗性及a-互補(bǔ)篩選陽性菌落進(jìn)行菌落PCR和EcoRⅠ酶切鑒定，獲得到

4、三種重組質(zhì)粒，分別命名為CTV-p25、CTV-p27和CTV-p20。 2.基因序列堿基組成分析 用DNAStar軟件對三個基因序列堿基組成進(jìn)行分析，編碼兩個外殼蛋白的p25和p27分別有672nt和723nt，堿基出現(xiàn)頻率均為A最高，其含量分別為28.87％和31.12％，堿基C最低，分別為18.60％和17.98％。p20全長有549nt，按照堿基出現(xiàn)頻率從高到低依次為T(160個)、G(139)、A(136個)、

5、C(114個)，其含量分別為29.14％、25.23％、24.77％和20.77％ 3.聚類分析 與GenBank收錄的9個已測全基因序列的CTV分離株的相同的三個基因進(jìn)行核酸和氨基酸聚類分析，核酸聚類分析中CT11的p25與VT、NuagA、SY568、T318A的聚類住一個大分支上，CT11的p27與西班牙強(qiáng)毒株T318A的聚類在一個分枝上，CT11的p20與T318A、NuagA的聚在一個小分支上。氬基酸進(jìn)化聚類分

6、析表明CT11的p25與SY568的聚類住一個分支上，p27和p20的氨基酸進(jìn)化樹與其核酸進(jìn)化樹反映的各分離株之間的親緣關(guān)系基本相同。 4.三個蛋白氨基酸組成和等電點(diǎn)預(yù)測 p25編碼223個氨基酸，其中強(qiáng)堿性氨基酸有31個，強(qiáng)酸性氨基酸有30個，疏水氨基酸73個，極性氨基酸61個。p25等電點(diǎn)為7.831，pH7.0時(shí)帶有1.329個正電荷。 p27編碼241個氨基酸，其中35個強(qiáng)堿性氨基酸，34個強(qiáng)酸性氨基酸，

7、74個疏水氨基酸，63個極性氨基酸。p27等電點(diǎn)為7.753，pH7.0時(shí)帶有1.475個負(fù)電荷。 p20編碼182個氨基酸。其中強(qiáng)堿性氨基酸有21個，強(qiáng)酸性氨基酸有22個，疏水氨基酸68個，極性氨基酸45個。p20等電點(diǎn)為6.979，pH7.0時(shí)帶有0.061個負(fù)電荷。 5.三個蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 p25和p27兩個外殼蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。p20的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主。 6.三個蛋白的跨膜區(qū)分