ROS依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬反應(yīng)在醉茄素A誘導(dǎo)人胰腺癌細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、第一部分醉茄素A通過氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)人胰腺癌細胞凋亡
　　目的:研究醉茄的活性成分醉茄素A(withaferinA,WA)對人胰腺癌細胞增殖、凋亡等的影響及其可能的作用機制。
　　方法:采用CCK-8法檢測細胞增殖活性;倒置顯微鏡觀察WA對細胞形態(tài)的影響;Hoechst33258熒光染色和AnnexinV–FITC/PI雙標流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡;JC-1熒光探針檢測細胞線粒體膜電位;PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞周期;West

2、ernBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白的變化;CM-H2DCFDA熒光探針標記檢測細胞內(nèi)活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)水平;最后使用泛Caspase家族激酶抑制劑Z-VAD-FMK和各種抗氧化劑干預(yù)細胞后,觀察細胞凋亡的變化。
　　結(jié)果:WA在體外對多種人胰腺癌細胞株均有一定的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用,且這種作用呈濃度和時間依賴性,但其對人正常細胞株的增殖抑制作用較小;WA可誘導(dǎo)人胰腺癌細胞線粒體膜電位下降,并

3、阻滯細胞周期于G2/M期;WesternBlot結(jié)果顯示,WA能引起Caspase-3、Caspase-9、PARP1的剪切激活和Bax/Bcl-2比值上調(diào);而Z-VAD-FMK可部分逆轉(zhuǎn)WA所誘導(dǎo)的細胞凋亡效應(yīng);同時WA還可顯著增加細胞內(nèi)的ROS水平,但當使用抗氧化劑NAC和Catalase清除細胞內(nèi)ROS后,細胞凋亡率也明顯減少。
　　結(jié)論:WA在體外可顯著抑制人胰腺癌細胞增殖,并阻滯細胞周期于G2/M期;WA能夠誘導(dǎo)細胞發(fā)生

4、凋亡,且這種凋亡依賴于Caspase家族的激活;另外,WA還可引起細胞內(nèi)ROS水平顯著增加,而WA誘導(dǎo)的細胞凋亡依賴于這種ROS的產(chǎn)生。
　　第二部分醉茄素A誘導(dǎo)保護性自噬作用的體內(nèi)外研究
　　目的:通過體內(nèi)外實驗研究WA是否誘導(dǎo)人胰腺癌細胞發(fā)生自噬及其生物學(xué)意義。
　　方法:采用透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。WesternBlot檢測自噬關(guān)鍵蛋白LC3B的表達情況。構(gòu)建pEGFP-LC3質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,激

5、光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色GFP-LC3點狀陽性細胞數(shù)比例。利用溶酶體探針LysoTrackerRedDND-99檢測GFP-LC3與溶酶體之間的空間定位關(guān)系。采用多種自噬抑制劑及RNAi技術(shù)沉默自噬關(guān)鍵基因Atg5后檢測細胞增殖和凋亡的變化。最后通過建立Panc-1裸鼠皮下移植瘤模型,在動物水平觀察單用WA或聯(lián)合使用自噬阻滯劑氯喹(chloroquine,CQ)后對胰腺癌細胞血管生成、增殖、凋亡和自噬等生物學(xué)特性的影響。
　　

6、結(jié)果:透射電鏡結(jié)果顯示,WA作用后細胞質(zhì)中可見大量空泡化雙層膜結(jié)構(gòu)及自噬體形成;WesternBlot結(jié)果顯示,WA可誘導(dǎo)自噬關(guān)鍵蛋白LC3B-Ⅱ的表達增加;激光共聚焦結(jié)果顯示,WA可誘導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-LC3質(zhì)粒的細胞出現(xiàn)大量GFP-LC3點狀聚集,并且這種綠色GFP-LC3與紅色LysoTrackerRed共定位;使用自噬溶酶體抑制劑與WA聯(lián)合作用后,細胞內(nèi)綠色GFP-LC3點狀聚集進一步增多,且WesternBlot顯示LC3

7、B-Ⅱ的表達也進一步增加;但另一種自噬阻滯劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)以及泛Caspase家族激酶抑制劑Z-VAD-FMK卻對WA誘導(dǎo)的LC3B-Ⅱ的表達無顯著影響;而當自噬溶酶體抑制劑與WA聯(lián)用后可增強其抑制細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng);同樣,當使用RNAi技術(shù)沉默自噬關(guān)鍵基因Atg5來抑制自噬后,可顯著增加WA誘導(dǎo)的細胞凋亡;裸鼠皮下移植瘤模型結(jié)果顯示:藥物干預(yù)21天后,單用WA組的腫瘤體積和重量與對照組

8、相比均有一定程度的減小(P<0.05);而當聯(lián)合使用自噬阻滯劑CQ后,腫瘤體積和重量均較單用WA組進一步減小(p<0.05);免疫組化結(jié)果顯示,單用WA組移植瘤組織血管標記蛋白CD34和腫瘤增殖抗原Ki67的表達較對照組均有一定程度的減少,而自噬相關(guān)蛋白p62/SQSTM1和LC3B的表達均明顯增加(P<0.05);當聯(lián)合使用CQ后CD34和Ki67的表達較單用WA組進一步下降(p<0.05),而p62/SQSTM1和LC3B的表達則進

9、一步增加(P<0.05);Tunel檢測顯示單用WA組較空白對照組細胞凋亡率升高(P<0.05),而聯(lián)合使用CQ后細胞凋亡率進一步增加(P<0.05)。
　　結(jié)論:WA在體內(nèi)、體外均可誘導(dǎo)人胰腺癌細胞發(fā)生自噬,且自噬可能是作為一種保護性應(yīng)激反應(yīng)來對抗細胞凋亡;WA誘導(dǎo)的細胞自噬不能被Caspase家族激酶抑制劑Z-VAD-FMK所阻滯,且不依賴于ClassⅢPI3K通路;單用WA可部分抑制裸鼠皮下移植瘤生長,而聯(lián)合自噬阻滯劑CQ后

10、可顯著抑制移植瘤生長并促進其凋亡。
　　第三部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)對醉茄素A誘導(dǎo)人胰腺癌細胞凋亡和自噬的影響及其機制研究
　　目的:探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)對WA誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡和自噬的影響及其分子機制。
　　方法:采用WesternBlot檢測相關(guān)蛋白的變化;觀察抑制mTOR通路后對WA誘導(dǎo)的細胞凋亡和自噬的影響;采用間接免疫熒光法和透射電鏡觀察細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的改變;間接免疫熒光法檢測泛素化蛋白(ubiquitin)、p62

11、/SQSTM1蛋白和GFP-LC3的共定位;采用免疫共沉淀技術(shù)檢測p62/SQSTM1與LC3B蛋白之間的相互作用關(guān)系;分別觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護劑Salubrinal和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素(Tunicamycin,TM)對WA誘導(dǎo)的細胞凋亡和自噬的影響;RNAi技術(shù)分別沉默相關(guān)關(guān)鍵基因CHOP、Atg5、p62/SQSTM1后檢測細胞泛素化蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白以及凋亡和自噬的變化;最后觀察抗氧化劑NAC對細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的影響。

12、
　　結(jié)果:WA誘導(dǎo)人胰腺癌細胞p62/SQSTM1表達上調(diào),但對其它自噬相關(guān)蛋白影響不大;WA能抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路,而抑制mTOR通路后能進一步增加細胞自噬并部分逆轉(zhuǎn)WA所誘導(dǎo)的細胞凋亡效應(yīng);WA誘導(dǎo)人胰腺癌細胞泛素化蛋白聚集,且聚集的泛素化蛋白與GFP-LC3共定位;WA誘導(dǎo)人胰腺癌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可減少WA誘導(dǎo)的細胞凋亡和自噬;相反,促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可增加WA誘導(dǎo)的細胞凋亡和自噬;并

13、且,抑制細胞自噬可增強WA誘導(dǎo)的泛素化蛋白聚集及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。WA上調(diào)p62/SQSTM1的基因轉(zhuǎn)錄水平,但不影響其蛋白降解,且p62/SQSTM1與LC3B蛋白為相互作用蛋白;下調(diào)p62/SQSTM1后可增強WA誘導(dǎo)的細胞凋亡、自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。最后,WA誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬反應(yīng)均可被抗氧化劑NAC所阻斷。
　　結(jié)論:ROS介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與了WA誘導(dǎo)的人胰腺癌細胞凋亡和自噬;WA誘導(dǎo)胰腺癌細胞發(fā)生自噬依賴于PI3