內質網應激在雙氫青蒿素誘導人肝癌HepG2細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、第一部分\ DHA對肝癌HepG2、前列腺癌PC-3、胃癌SGC7901及結腸癌Caco2細胞增殖抑制的研究
　　 目的：比較雙氫青蒿素（DHA）對四種腫瘤細胞的體外生長抑制作用，以篩選出最敏感的細胞株進行作用機制的研究。
　　 方法：噻唑藍（MTT）比色法評價DHA對人肝癌HepG2，前列腺癌PC-3，胃癌SGC7901及結腸癌Caco2細胞的增殖抑制作用；流式細胞術檢測DHA對上述四種細胞凋亡率的影響。
　　

2、 結果：四種細胞的各對照組與DMSO組之間細胞增殖比較無統計學差異（P>0.05）；DHA對每種細胞的抑制率與DHA濃度和作用時間正相關（P<0.05），相同時間，HepG2各濃度組的抑制率與其他三種細胞相應濃度組比較有明顯差異（P<0.01，除外25μmol/L DHA24h組P<0.05）；作用24h后，每種細胞株各DHA濃度組的細胞凋亡率均明顯高于對照組（P<0.01）。四種細胞株中，DHA對HepG2細胞的抑制作用最強，其中DH

3、A（200μmol/L）作用48h時達最高增殖抑制率（86.46±19.65）％，DHA（100μmol/L）作用24時達最高凋亡率（31.74±2.80）％。
　　 結論：DHA明顯抑制四種細胞株的增殖并誘導其凋亡，其中HepG2最為敏感。
　　 第二部分、 DHA誘導人肝癌HepG2細胞凋亡啟動因素的研究
　　 目的：探討DHA誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的啟動因素。
　　 方法：用0、50、100和

4、200μmol/L DHA作用HepG2細胞6h、24h后，采用熒光探針2'，7'-二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉（DCFH-DA）及Fluo-3AM裝載檢測細胞內活性氧（ROS）含量及Ca2+濃度；采用流式細胞儀檢測線粒體膜電位（△Ψm）變化及透射電鏡觀察DHA作用HepG2后細胞超微結構的變化。
　　 結果：與對照組相比，DHA作用細胞后，細胞內熒光度值顯著增加（P<0.01），且具有明顯的濃度與時間依賴性，而具有濃度依賴的胞漿游離

5、Ca2+濃度增加及線粒體膜電位降低均出現在DHA作用24h組；DHA100μmol/L作用24h透射電鏡觀察，可見大量凋亡細胞及內質網顯著擴張?？寡趸瘎㎞AC（5mmol/L）可明顯抑制DHA的上述作用。
　　 結論：DHA明顯增加細胞中ROS水平及Ca2+濃度，降低線粒體膜電位，ROS的產生可能位于上游環(huán)節(jié)。
　　 第三部分、 DHA誘導人肝癌HepG2細胞內質網應激凋亡信號轉導機制的研究
　　 目的：研究DH

6、A誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的內在作用機制。
　　 方法：用DHA、DHA+NAC及DHA+SP600125作用HepG2細胞，MTT比色法檢測細胞增殖抑制的效果；流式細胞術檢測細胞凋亡的情況；掃描電鏡觀察DHA作用后細胞超微結構的變化；逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測CHOP，XBP1及ATF4 mRNA的表達，蛋白印跡技術（Western Blot）及免疫細胞化學檢測CHOP，p-JNK，Bax及Bcl-2蛋白的表

7、達。
　　 結果：DHA對HepG2細胞的增殖抑制率與DHA濃度和作用時間相關（P<0.05），NAC在24h及48h均可抑制DHA的作用，除JNK的特異性抑制劑SP600125在48h高濃度組（50，100，200μmol/L）對DHA的作用沒有明顯影響外，在其他組中可部分抑制DHA的作用；DHA組24h細胞凋亡率明顯高于對照組，且與DHA濃度正相關（P<0.05），NAC及SP600125均可抑制DHA的作用；電鏡觀察顯示，

8、DHA作用后細胞表面微絨毛減少和消失，凋亡細胞可見大小不等球狀的突起及凋亡小體，壞死細胞的細胞膜破裂，胞漿外溢；RT-PCR檢測發(fā)現DHA可上調CHOP，XBPlu、XBPls及ATF4 mRNA的表達，Western Blot及免疫細胞化學檢測發(fā)現DHA上調CHOP及Bax蛋白的表達，下調Bcl-2表達，NAC可抑制DHA對上述相關基因與蛋白的調節(jié)；Western-Blot在DHA作用6h時檢測出JNK的磷酸化，NAC及SP60012

9、5均可抑制p-JNK的表達。
　　 結論：DHA激活UPR的三條信號通路（PERK、AFF6、IRE1），通過激活CHOP，JNK而誘導內質網應激凋亡途徑，ROS在這一過程中具有重要的作用。
　　 第四部分、 DHA對裸鼠人肝癌HepG2細胞移植瘤生長抑制的研究
　　 目的：研究DHA對裸鼠人肝癌HepG2移植瘤生長的抑制作用。
　　 方法：采用皮下接種肝癌HepG2細胞懸液的方法構建裸鼠的移植瘤模型，觀

10、察DHA在體內對HepG2細胞的生長抑制作用；逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及免疫組化檢測CHOP、Bax、Bcl-2及p-JNK的表達情況；透射電鏡觀察肝癌組織超微結構的改變。
　　 結果：與對照組相比，瘤體積及瘤重量明顯降低（P<0.05），抑瘤率達50.91％，而對照組與DHA組裸鼠體重無明顯差異（P>0.05）；RT-PCR及免疫組化顯示DHA可上調腫瘤組織中CHOP、Bax的表達水平，下調Bcl-2的表達，差異有