ROS在硫酸鎳誘導(dǎo)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡通路中的作用.pdf

1、目的：通過體外培養(yǎng)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，觀察硫酸鎳致大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞ROS水平與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，探討ROS在鎳誘導(dǎo)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體凋亡通路中的作用。
　　方法：（1）采用0.25％膠原酶消化大鼠睪丸組織分離出睪丸間質(zhì)細(xì)胞，Percoll連續(xù)梯度分離液對其進(jìn)行純化，并采用貼壁培養(yǎng)法再次純化。通過3β-HSD對純化后的細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定。（2）純化后的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，

2、給予不同濃度（0、250、500和1000μmol/L）NiSO4分別處理0、6、12和24h，通過MTT法和LDH滲漏法檢測各組細(xì)胞存活率和培養(yǎng)液中LDH活力。（3）取對數(shù)生長期間質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)自由基清除劑NAC和TEMPO提前干預(yù)1h后，再行500μmol/L NiSO4處理12h。采用DCFH-DA探針法觀察大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，DAPI熒光染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。采

3、用Western blot法檢測大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 GRP78、GADD153和Caspase-12，以及線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bak、Cyt C、Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：（1）純化的間質(zhì)細(xì)胞貼壁生長24h后，通過3β-HSD染色法鑒定，可得到純度較高的間質(zhì)細(xì)胞。（2）與對照組比較，250、500和1000μmol/L NiSO4分別處理6、12和24h后，不同處理組細(xì)胞存活率

4、均顯著下降（P＜0.05），細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力均顯著升高（P＜0.05），且隨著NiSO4處理濃度和時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力也逐漸升高。（3）與對照組比較，500μmol/L NiSO4處理12h組（NiSO4組）熒光顯微鏡下可見間質(zhì)細(xì)胞中ROS水平明顯升高。與NiSO4組比較，經(jīng)5mmol/L NAC（NAC組）和1mmol/L TEMPO（TEMPO組）干預(yù)后，間質(zhì)細(xì)胞中ROS水平明顯下降（P＜0

5、.05）。DAPI熒光染色后，鏡下可見NiSO4組細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核固縮或裂解，呈梭狀和鐮刀狀，部分染色質(zhì)呈現(xiàn)濃縮狀態(tài)，可見凋亡小體；NAC組細(xì)胞核可見固縮，邊緣呈梭狀，不完整；TEMPO組細(xì)胞核大多為正常圓形，少見固縮和不完整邊緣的細(xì)胞核，凋亡小體明顯減少。流式細(xì)胞術(shù)定量檢測細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，NiSO4組間質(zhì)細(xì)胞凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與NiSO4組比較，NAC組和TEMPO組間質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)量均

6、明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，NiSO4組間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、GADD153和Caspase-12以及線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bak、Cyt C、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與NiSO4組比較，NAC組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而TEMPO組除Caspase-3以外，其他蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，