內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬和凋亡在重組新城疫病毒rL-RVG引起人胃癌細胞死亡中的作用.pdf

1、組織缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子損耗、病毒性感染以及某些影響鈣離子平衡、蛋白質(zhì)糖基化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體膜泡轉(zhuǎn)運的因素都會干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，導(dǎo)致未折疊蛋白或錯誤蛋白積聚，稱為未折疊反應(yīng)（UPR）。這種未折疊蛋白增加被稱為“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激”，決定著細胞是存活還是走向死亡。
　　新城疫病毒（Newcastle disease virus，DNV）作為一種禽類副粘病毒，已作為溶瘤病毒研究多年，以其對腫瘤細胞高選擇性及腫瘤細胞內(nèi)高復(fù)制，被認為下一代抗癌藥物的

2、新選擇。
　　本文觀察凋亡、自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在穩(wěn)定表達病毒糖蛋白的重組新城疫病毒（rL-RVG）引起人胃癌細胞死亡中的作用，探討rL-RVG所引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡之間的相互關(guān)系，為rL-RVG成為治療胃癌的候選藥物提供了分子基礎(chǔ)。相關(guān)研究如下：
　　1. rL-RVG感染誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　rL-RVG和NDV分別感染胃癌細胞后，首先通過Western Blot實驗方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白GRP78及

3、CHOP的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GRP78及CHOP的表達明顯上升，而后通過免疫熒光再次證明，rL-RVG和NDV促進GRP78及CHOP蛋白的表達，且rL-RVG作用更強，揭示rL-RVG感染誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　2. rL-RVG感染胃癌細胞激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1通路
　　rL-RVG和NDV分別感染胃癌細胞后，首先通過Western Blot實驗方法檢測IRE1通路蛋白XBP-1蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)XBP-1表達上

4、調(diào)，然后通過半定量PCR檢測未切割uXBP-1 mRNA及切割后sXBP-1 mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)在rL-RVG感染SGC-7901細胞12 h后，檢測到sXBP-1 mRNA的表達，揭示rL-RVG激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1通路。
　　3. rL-RVG感染胃癌細胞激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ATF6通路
　　rL-RVG和NDV分別感染胃癌細胞后，通過Western Blot實驗方法檢測ATF6通路相關(guān)蛋白ATF6切割情況，實驗發(fā)現(xiàn)，

5、 rL-RVG和NDV組明顯檢測到p50-ATF6的表達上調(diào)，且rL-RVG組上調(diào)更加明顯，證實rL-RVG感染胃癌細胞激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ATF6通路。
　　4. rL-RVG感染胃癌細胞激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路
　　rL-RVG和NDV分別感染胃癌細胞后，通過Western Blot實驗方法檢測PERK通路相關(guān)蛋白蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)rL-RVG組和NDV組eIF2α磷酸化水平明顯提高，然而總的eIF2α未見明顯變化。實驗證明

6、rL-RVG感染胃癌細胞激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路。
　　5. rL-RVG感染胃癌細胞通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)發(fā)生自噬與凋亡
　　使用4PBA預(yù)處理兩小時后，用病毒感染胃癌細胞24h，Western Blot實驗方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)不僅內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白降低，自噬及凋亡相關(guān)蛋白同時也明顯降低。進一步流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，4PBA預(yù)處理明顯降低細胞凋亡率。再進一步用CHOP-siRNA干擾胃癌細胞CHOP基因

7、，然后加入病毒24h后檢測自噬及凋亡蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)自噬及凋亡蛋白明顯降低。充分證明rL-RVG誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)自噬及凋亡的發(fā)生。
　　6. rL-RVG感染胃癌細胞誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過IRE1/JNK/beclin-1通路調(diào)控細胞自噬
　　rL-RVG和NDV分別感染胃癌細胞后，細胞內(nèi)JNK蛋白磷酸化水平明顯提高，而總JNK未見明顯變化，beclin-1蛋白表達提高明顯。使用特殊的JNK抑制劑（SP60015）預(yù)處理2

8、 h后感染病毒，24后檢測自噬及凋亡蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)自噬及凋亡蛋白表達下降。實驗充分證明rL-RVG感染胃癌細胞誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過IRE1/JNK/beclin-1通路調(diào)控細胞自噬。
　　7．rL-RVG感染胃癌細胞自噬調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡
　　使用自噬抑制劑3MA預(yù)處理12小時后，用病毒感染胃癌細胞24小時， Western Blot實驗方法檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡相關(guān)蛋白