類固醇受體輔激活因子SRC-3在小鼠電離輻射所致造血損傷中的調控保護作用及機制研究.pdf

1、造血組織對電離輻射極為敏感，是輻射損傷的主要靶器官之一。輻射射線可導致造血細胞大量凋亡或死亡，使細胞周期改變，細胞增殖遲緩，導致機體出現(xiàn)嚴重造血功能障礙。與此同時，電離輻射還可降低骨髓中基質細胞的數(shù)目和分泌細胞因子的能力，進一步阻礙輻射后造血機能的恢復。因此，盡量保護殘存造血細胞的數(shù)量、促進照后造血細胞的增殖和維持照后造血微環(huán)境的穩(wěn)定，是治療輻射后造血損傷的有效措施。而如何同時在造血細胞和基質細胞中實現(xiàn)多途徑、多靶點的輻射后保護，是治療

2、急性放射病造血損傷時新的思考。
　　類固醇受體輔激活因子-3(steroidreceptorcoactivator-3，SRC-3)是SRC家族中重要的一員，能夠與多種核受體和轉錄因子相互作用，參與激活多條信號通路，完成相應靶基因的轉錄。SRC-3不僅能在機體中發(fā)揮了廣泛的生物學功能;更作為促瘤因子參與促進多種腫瘤細胞的增殖和生長，以及對抗化療藥物引起的凋亡。已有報道證實，SRC-3在惡性血液細胞中高表達，并能發(fā)揮促增殖和對抗藥物

3、所致凋亡的作用。因此我們推斷，SRC-3可能在外因所致的造血細胞損傷中發(fā)揮一定作用。目前，對SRC-3參與體內造血調控的機制尚不清楚，關于在輻射所致造血損傷中的作用更是未見報道。為了驗證SRC-3是否參與了小鼠輻射后造血損傷效應，并探明其相關機制，我們以SRC-3基因敲除型和野生型小鼠為實驗對象開展了以下實驗。
　　我們通過海外合作的方式從美國休斯敦貝勒醫(yī)學院引進SRC-3基因敲除小鼠的親代小鼠，并在成功繁殖和進行基因表型鑒定后，

4、獲得一批理想的SRC-3基因敲除型和野生型實驗用小鼠。在對所得實驗小鼠按照不同基因型分組后，我們以60Coγ射線分別進行了6.0Gy和4.5Gy的全身照射(totalbodyirradiation，TBI)，制造了致死劑量照后和亞致死劑量照后兩種不同的動物輻射損傷模型。
　　為了明確SRC-3在小鼠電離輻射所致造血損傷中的效應及探討其相關機制，我們分別從體內、體外兩方面展開實驗。首先，我們評估了SRC-3-/-小鼠和野生型小鼠在輻

5、射后不同的造血損傷效應，包括整體效應，如小鼠一般情況、死亡率、體重等指標;外周血細胞、骨髓造血組織、胸腺和脾臟淋巴組織的損傷情況;并檢測了小鼠血清中造血相關細胞因子(IGF-1，IL-3，IL-6，TPO)的水平變化，驗證了SRC-3在小鼠體內輻射后造血損傷和造血恢復過程中均能發(fā)揮防護作用。其次，我們以小鼠細胞作為實驗對象，分兩部分探討了SRC-3參與調控和保護小鼠輻射后造血損傷的機制:1）以兩種不同基因型小鼠的骨髓有核細胞(bonem

6、arrownucleatedcells，BMNCs)作為研究對象，在輻射前和輻射后各時相點，檢測了SRC-3對小鼠BMNCs細胞的凋亡、增殖、細胞周期、相關增殖通路的影響，以及對凋亡相關分子(NF-κB，p53，Bcl-2，Bax)和周期調控因子(cyclinA，E，D1，CDK2，CDK4，p21，p53)的調控作用，闡明了SRC-3在輻射后的小鼠BMNCs中的調控和保護作用。2）以兩種不同基因型小鼠的骨髓基質細胞(bonemarro

7、wstromalcells，BMSCs)作為研究對象，在輻射前和輻射后各時相點，檢測了SRC-3對小鼠BMSCs細胞的增殖活性、成纖維細胞集落形成單位(colony-formingunitoffibroblast，CFU-F)形成能力、增殖相關p-AKT蛋白表達量，和上清中VCAM-1，IGF-1，IL-3，IL-6和TPO水平的影響，明確了SRC-3在小鼠BMSCs細胞中的調控作用。所得結果總結如下:
　　主要結果:
　　

8、1.以SRC-3+/-雜合子小鼠為親代交配繁殖得到一定數(shù)目的野生型（SRC-3+/+）、雜合子（SRC-3+/-）和基因敲除的純合子(SRC-3-/-)小鼠。通過PCR和Westernblot方法分別對子代小鼠進行基因表型和蛋白表型的鑒定后，將所得SRC-3-/-小鼠SRC-3+/+小鼠分組供實驗用。蛋白表型鑒定結果發(fā)現(xiàn)SRC-3-/-小鼠中SRC-3基因已經徹底敲除，其骨髓、脾臟和胸腺組織中未測得SRC-3蛋白的表達;而野生型小鼠中骨

9、髓細胞的SRC-3蛋白的表達水平顯著高于其在脾臟和胸腺中的表達水平(P＜0.05)。
　　2.SRC-3-/-小鼠與同齡野生型小鼠比較，具有體重輕、身材短小、發(fā)育遲緩，成年雌鼠性成熟障礙，不易受孕等特點。正常情況下，與野生型比較，SRC-3-/-小鼠體重和血清中IGF-1水平顯著偏低，兩者比較存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。并且發(fā)現(xiàn)，SRC-3-/-小鼠的外周血中WBC、RBC和PLT計數(shù)和骨髓有核細胞計數(shù)均略低于野生型;胸腺指數(shù)

10、、脾臟指數(shù)略高于野生型，但兩者比較無統(tǒng)計學差異。
　　3.給予致死劑量TBI后，SRC-3-/-小鼠顯現(xiàn)出更嚴重的整體損傷效應，表現(xiàn)為一般情況更差、體重下降明顯，30天生存率更低，與野生型比較存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，提示SRC-3-/-小鼠機體抗輻射能力更弱。
　　4.給予亞致死劑量TBI后，SRC-3-/-小鼠中外周血血象更低，骨髓有核細胞計數(shù)和造血集落形成單位計數(shù)更少，與野生型比較存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

11、同時骨髓病理切片提示所見輻射后SRC-3-/-小鼠的骨髓更空曠。提示SRC-3-/-小鼠輻射后顯現(xiàn)出更加嚴重的外周血和骨髓的造血損傷效應。值得一提的是，SRC-3-/-小鼠的巨核系造血細胞在輻射后損傷尤重，在照射后11天極低點至隨后恢復過程中的各時相點，均可觀察到SRC-3-/-小鼠的外周血PLT計數(shù)、病理切片中骨髓腔巨核細胞數(shù)目和體外培養(yǎng)巨核系集落形成單位顯著低于野生型，兩者比較存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　5.給予亞致

12、死劑量TBI后，在各個時相點可觀察到，SRC-3-/-小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均略高于野生型，并與野生型比較無統(tǒng)計學差異。說明SRC-3-/-小鼠脾臟和胸腺的輻射后損傷程度明顯低于骨髓損傷程度，因此SRC-3-/-小鼠的淋巴組織在輻射后的損傷效應與骨髓組織有所不同。
　　6.給予亞致死劑量TBI后，SRC-3-/-小鼠血清中IGF-1水平在照后各時相點持續(xù)處于較低水平，與野生型比較存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。SRC-3-/-小

13、鼠血清中造血因子IL-3和IL-6在照后第7天顯著均低于野生型，兩者比較存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。血清中細胞因子TPO水平則未發(fā)現(xiàn)存在組間差異。
　　7.用流式法測定兩組小鼠的BMNCs的凋亡率和所含Sca-1+細胞比例后發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，兩種小鼠BMNCs的凋亡率和所含Sca-1+細胞比例無統(tǒng)計學差異。而輻射后SRC-3-/-小鼠的BMNCs中凋亡率顯著升高和Sca-1+細胞比例顯著降低，與野生型比較存在統(tǒng)計學差異(P＜

14、0.05)。同時，用Westernblot方法測得輻射后SRC-3-/-小鼠BMNCs中的凋亡蛋白p53和Bax表達顯著升高，抗凋亡蛋白NF-κB(p65)和Bcl-2表達顯著降低，與野生型比較存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。提示SRC-3-/-小鼠的BMNCs在輻射后凋亡增多、殘留數(shù)目較少;其增高的凋亡敏感性與凋亡相關蛋白的表達量異常有關。
　　8.用流式法測定兩組小鼠的BMNCs的細胞周期和增殖指數(shù)后發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，兩種小

15、鼠BMNCs的細胞周期分布和增殖指數(shù)無統(tǒng)計學差異。而輻射后SRC-3-/-小鼠的BMNCs表現(xiàn)出G0/G1期顯著升高，S期阻滯的特點，同時增殖指數(shù)也顯著低于野生型(P＜0.05)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，輻射后SRC-3-/-小鼠BMNCs中正性周期調控因子，包括CyclinD1、CyclinE、CyclinA、CDK2、CDK4的表達水平顯著降低;負性周期調控因子p53和p21的蛋白表達量顯著升高，與野生型比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。并

16、且，SRC-3-/-小鼠BMNCs中p-AKT蛋白表達量在輻射后下降，表明SRC-3-/-小鼠AKT增殖信號通路在輻射后活性降低。以上結果提示SRC-3-/-小鼠的BMNCs在輻射后存在細胞周期分布異常和增殖障礙的特點，其中周期調控因子的表達水平和的AKT信號通路活性輻射后降低，是導致輻射后造血恢復緩慢的重要原因。
　　9.用CKK-8法測定體外培養(yǎng)所得小鼠BMSCs的增殖活性后發(fā)現(xiàn)，正常情況下，SRC-3-/-小鼠的增殖活性顯著

17、低于野生型(P＜0.05);而輻射后兩者組間差異更加顯著(P＜0.01)。并且，SRC-3-/-小鼠的CFU-F形成能力在照前和照后均顯著低于野生型，兩者比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。另外，我們還檢測了小鼠BMSCs中調控增殖的AKT信號通路活性，發(fā)現(xiàn)照前兩組小鼠BMSCs中p-AKT蛋白表達量水平接近;但在照后SRC-3-/-小鼠BMSCs中p-AKT蛋白表達量顯著低于野生型，兩組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。以上結果說明SR

18、C-3-/-小鼠BMSCs的增殖能力和CFU-F形成能力在照射前降低，輻射后程度加重;而照射后SRC-3-/-小鼠BMSCs中AKT增殖信號通路活性降低可能是導致該損害加重的一個重要原因。
　　10.用ELISA法測定小鼠BMSCs細胞培養(yǎng)上清液中的細胞因子水平后發(fā)現(xiàn)，正常情況下，SRC-3-/-小鼠BMSCs上清中VCAM-1和IGF-1水平偏低，與野生型比較存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。而輻射損傷后，SRC-3-/-小鼠BM

19、SCs上清中VCAM-1、IGF-1、IL-3和IL-6水平均顯著低于野生型，兩者比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，說明SRC-3-/-小鼠BMSCs分泌細胞因子的能力顯著低于野生型。
　　結論:
　　1.缺乏SRC-3可增加致死劑量TBI后小鼠死亡率，表明SRC-3可以影響輻射后小鼠的存活率，在整體水平上提高小鼠對輻射損傷的防護能力。
　　2.缺乏SRC-3可導致亞致死劑量TBI后，小鼠骨髓損傷更重、造血恢復更緩慢

20、。因此，SRC-3能減輕小鼠輻射后骨髓造血損傷程度，促進造血恢復，特別是對巨核系造血影響更加明顯。
　　3.SRC-3與維持血清中IGF-1、IL-3和IL-6水平有密切關系。缺乏SRC-3可導致照射前后血清中的細胞因子IGF-1顯著降低，以及照射后血清中IL-3和IL-6水平嚴重不足。
　　4.SRC-3可保護輻射后小鼠BMNCs中存活的Sca-1+細胞和降低凋亡細胞，并通過激活NF-κB(p65)蛋白和抑制p53蛋白輻射

21、后的活性，降低小鼠BMNCs輻射后凋亡敏感性。
　　5.SRC-3可促進輻射后小鼠BMNCs的增殖和周期進程，降低G0/G1期比例，減少S期阻滯。其機制與上調正性周期調控因子CyclinD1、CyclinE、CyclinA、CDK2、CDK4和下調負性周期調控因子p21和p53的表達水平，激活AKT信號通路有關。
　　6.缺乏SRC-3可導致正常情況下小鼠BMSCs的增殖活性、CFU-F形成能力，以及BMSCs上清中VCAM