縫隙連接在HCY和TGF-β1介導大鼠血管平滑肌細胞增殖中的作用及機制研究.pdf

1、目的:探討縫隙連接在同型半胱氨酸(Hcy)和轉化生長因子β1(TGF-β1)介導大鼠血管平滑肌細胞增殖中作用及機制。
　　方法:(1)用組織貼塊法原代培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(VSMC),用胰蛋白酶消化法進行細胞傳代培養(yǎng),α-平滑肌肌動蛋白(α-Actin)相關抗原鑒定。取3-5代細胞,MTT法檢測不同濃度Hcy(0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5mmol/L)和不同濃度TGF-β1(0、0.01、0

2、.1、1、10ng/mL),作用不同時間(0、12、24、48、72h)對VSMC增殖的影響,確定Hcy和TGF-β1作用濃度和作用時間,然后分8組:Control組、Hcy組、TGF-β1組、Hcy+TGF-β1組、縫隙連接阻斷劑(18α-GA)組、Hcy+18α-GA組、TGF-β1+18α-GA組和Hcy+TGF-β1+18α-GA組;(2)MTT法及流式細胞儀檢測大鼠VSMC增殖活性;(3)免疫熒光技術觀察大鼠VSMC中Cx43

3、、Cx40蛋白表達及定位;(4)Westernblotting技術檢測大鼠VSMC中Cx43、Cx40蛋白表達;(5)染料示蹤分子傳遞法(劃痕標記染料傳輸法)檢測大鼠VSMC縫隙連接功能。(6)實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK法檢驗。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:(1)大鼠VSMC中Cx43與Cx40蛋白表達呈陽性,兩者共

4、定位于胞漿。(2)MTT法檢測不同濃度Hcy、TGF-β1,不同作用時間對大鼠VSMC增殖影響的結果發(fā)現(xiàn):Hcy對大鼠VSMC的增殖呈現(xiàn)時間依賴性,隨時間延長VSMC增殖增加。不同濃度Hcy對VSMC增殖的影響呈現(xiàn)出復雜的效應。與Control組相比,低濃度時(0.01mmol/L)抑制增殖,至0.025mmol/L時,促進增殖;0.05mmol/L時,增殖減緩;至高濃度(0.1mmol/L),增殖最大;濃度進一步升高至0.2mmol/

5、L、0.5mmol/L時,增殖趨勢變緩。Hcy濃度0.1mmol/L在24h時,與其他各濃度均有統(tǒng)計學差異,增殖最顯著。TGF-β1對大鼠VSMC增殖的影響呈現(xiàn)時間依賴性和濃度依賴性。隨時間延長VSMC增殖增加。濃度為0.01ng/mL和0.1ng/mL時,與control組相比無統(tǒng)計學差異;至1ng/mL、10ng/mL時,增殖顯著,且10ng/mL和1ng/mL相比,在24h和48h時增殖更顯著。(3)MTT法檢測不同處理因素對大鼠

6、VSMC增殖影響的結果發(fā)現(xiàn):與Control組相比,Hcy組、TGF-β1組VSMCA570值增加顯著(P<0.05),18α-GA組VSMCA570值減少(P<0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA組VSMCA570值減少(P<0.05);與TGF-β1組相比,TGF-β1+18α-GA組VSMCA570值減少(P<0.05);與Hcy組、TGF-β1組相比,Hcy+TGF-β1組VSMCA570值減少(P<0.05)。(4

7、)細胞周期檢測:與Control組相比,Hcy組VSMCS值增加顯著(P<0.05),TGF-β1組VSMCS值有增加趨勢,但無統(tǒng)計學差異。18α-GA組VSMCS值減少(P<0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA組VSMCS值降低(P<0.05);與TGF-β1組相比,TGF-β1+18α-GA組VSMCS值降低(P<0.05);與Hcy組、TGF-β1組相比,Hcy+TGF-β1組VSMCS值降低(P<0.05)。(5)W

8、esternblotting檢測發(fā)現(xiàn):①各組間Cx40表達的變化:與Control組相比,Hcy組、TGF-β1組表達增強(P<0.05),18α-GA組無顯著差異(P>0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA組表達減弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1組表達減弱(P<0.05);與TGF-β1組相比,TGF-β1+18α-GA組表達減弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1組表達減弱(P<0.05)。與Hcy+TGF-β1

9、組相比,Hcy+TGF-β1+18α-GA組表達減弱(P<0.05)。②各組間Cx43表達的變化:與Control組相比,Hcy組、TGF-β1組表達增強(P<0.05),18α-GA組無顯著差異(P>0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA組表達減弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1組表達減弱(P<0.05);與TGF-β1組相比,TGF-β1+18α-GA組表達減弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1組表達減弱(P<0

10、.05)。與Hcy+TGF-β1組相比,Hcy+TGF-β1+18α-GA組表達無顯著差異(P>0.05)。③各組間磷酸化Cx43(P-Cx43)與非磷酸化Cx43(NP-Cx43)比值變化:與Control組相比,Hcy組表達無顯著差異(P>0.05),TGF-β1組表達減弱(P<0.05),18α-GA組顯著減弱(P<0.05);與TGF-β1組相比,TGF-β1+18α-GA組表達減弱(P<0.05)。(6)劃痕標記染料傳輸法檢測

11、發(fā)現(xiàn):與Control組相比,Hcy組明顯增強(P<0.05),TGF-β1、Hcy+TGF-β1組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),18α-GA組顯著減弱(P<0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA組減弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1組減弱(P<0.05);與TGF-β1組相比,TGF-β1+18α-GA組減弱(P<0.05),Hcy+TGF-β1組無顯著差異(P>0.05)。與Hcy+TGF-β1組相比,Hcy+T

12、GF-β1+18α-GA組減弱(P<0.05)。
　　結論:(1)TGF-β1主要通過上調(diào)大鼠血管平滑肌細胞Cx40、Cx43蛋白表達及抑制Cx43蛋白磷酸化,從而促進了大鼠血管平滑肌細胞的增殖;(2)Hcy主要通過上調(diào)大鼠血管平滑肌細胞Cx40、Cx43的蛋白表達,引起縫隙連接通訊功能的增強,促進了大鼠血管平滑肌細胞的增殖;(3)TGF-β1和Hcy聯(lián)合作用可能通過下調(diào)大鼠血管平滑肌細胞Cx40、Cx43蛋白表達,對大鼠血管平滑