雷帕霉素靶蛋白通路激活在脂代謝紊亂介導(dǎo)的靶器官損傷中的作用研究.pdf

1、目的：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)所致心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)常見的并發(fā)癥和主要死亡原因。與AS發(fā)生相關(guān)的主要危險(xiǎn)因素包括脂代謝異常和微炎癥反應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥在加速脂代謝紊亂介導(dǎo)的AS等靶器官損傷中扮演重要作用。炎癥能夠通過(guò)介導(dǎo)低密度脂蛋白受體(low-densitylipoprotein

2、receptor, LDLr)表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇攝入增加，破壞細(xì)胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，但該作用可被雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin, mTOR)抑制劑-雷帕霉素所抑制，提示mTOR信號(hào)激活可能參與了炎癥誘導(dǎo)的LDLr表達(dá)失調(diào)。然而，mTOR信號(hào)如何被激活、活化的mTOR信號(hào)是否參與LDLr的表達(dá)失調(diào)以及具體的作用機(jī)制如何，目前尚不十分清楚。因此，本研究擬在此基礎(chǔ)上，通過(guò)臨床研究，體內(nèi)、體外

3、研究，探討mTOR通路激活在炎癥及脂代謝紊亂介導(dǎo)的靶器官損傷中的作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法:研究?jī)?nèi)容包括血管損傷和肝臟損傷研究，血管損傷研究又包括臨床研究和基礎(chǔ)研究。血管損傷臨床研究，觀察炎癥誘導(dǎo)LDLr表達(dá)失調(diào)在ESRD患者橈動(dòng)脈泡沫細(xì)胞(foam cell，F(xiàn)C)形成中的作用，并初步探討mTOR通路激活與LDLr表達(dá)失調(diào)是否具有相關(guān)性。30例ESRD患者被納入研究，根據(jù)血清C反應(yīng)蛋白水平分為對(duì)照組(n=16)和炎癥組(

4、n=14)，取材動(dòng)-靜脈內(nèi)瘺手術(shù)時(shí)部分切除的橈動(dòng)脈組織。搜集兩組患者的基礎(chǔ)臨床資料，采用HE及油紅O染色觀察橈動(dòng)脈內(nèi)FC形成情況，免疫化學(xué)染色檢測(cè)mTOR、LDLr及其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)因子的表達(dá)。血管損傷基礎(chǔ)研究，觀察mTORC1激活在炎癥介導(dǎo)AS發(fā)生中的作用，探索mTORC1在LDLr負(fù)反饋調(diào)節(jié)失調(diào)中的作用及可能作用機(jī)制。體內(nèi)研究，將高脂喂養(yǎng)的8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout, ApoE

5、 KO)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，炎癥組，雷帕霉素組，炎癥+雷帕霉素組。8周后處死小鼠，收集血漿標(biāo)本及主動(dòng)脈組織;體外研究，選擇脂多糖刺激大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)，同時(shí)應(yīng)用雷帕霉素或siRNA方法抑制mTOR活性。ApoE KO小鼠血清用于檢測(cè)脂質(zhì)譜及炎癥因子水平，HE及油紅O染色觀察胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，免疫組化、免疫熒光染色、Real-time PCR及We

6、stern Blot法檢測(cè)組織及細(xì)胞內(nèi)LDLr負(fù)反饋通路調(diào)節(jié)因子、mTORC1信號(hào)通路相關(guān)蛋白以及細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)情況。肝臟損傷研究，觀察mTORC1激活在炎癥介導(dǎo)肝臟損傷發(fā)生中的作用，探討mTORC1對(duì)LDLr轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)失調(diào)的影響。體內(nèi)研究所用的動(dòng)物模型，與第二部分相同，觀察對(duì)象為肝臟組織。體外研究，應(yīng)用白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)聯(lián)合雷帕霉素或mTOR siRNA方法，干預(yù)人肝細(xì)胞株(Hum

7、an hepatoblastoma cell line，HepG2 cell)，并通過(guò)病理染色及化學(xué)酶促-比色法觀察肝臟細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況，免疫組化、免疫熒光染色、Real-time PCR及Western Blot法檢測(cè)組織及細(xì)胞內(nèi)LDLr轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)因子以及mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)情況。
　　結(jié)果:1）炎癥組與對(duì)照組ESRD患者在臨床基本生化等指標(biāo)均無(wú)明顯差異;炎癥組患者橈動(dòng)脈腫瘤壞死因子(tumor necros

8、is factor, TNF-α)及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotacticprotein1，MCP-1)表達(dá)增加，并伴隨大量脂質(zhì)沉積;對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇攝取的LDLr進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)炎癥組患者橈動(dòng)脈LDLr表達(dá)及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2（sterol regulatory dementbinding protein-2，SREBP-2）裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein

9、，SCAP）由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)位顯著增加。進(jìn)一步分析顯示，炎癥組LDLr表達(dá)增加與mTOR表達(dá)上調(diào)呈顯著正相關(guān)(r=0.733，p＜0.05);且炎癥組mTOR與SREBP-2共表達(dá)明顯高于對(duì)照組。2）通過(guò)皮下注射酪蛋白，成功構(gòu)建微炎癥動(dòng)物模型，且炎癥能夠誘導(dǎo)脂質(zhì)重分布，由血液循環(huán)向主動(dòng)脈組織內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，而雷帕霉素組小鼠主動(dòng)脈形態(tài)完整，且僅少量脂質(zhì)沉積;這一效應(yīng)與炎癥誘導(dǎo)mTOR激活，導(dǎo)致LDLr負(fù)反饋調(diào)節(jié)失衡密切相關(guān)，炎癥增加LDLr

10、、SREBP-2、SCAP表達(dá)，并促進(jìn)SCAP由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體共轉(zhuǎn)位;然而，應(yīng)用雷帕霉素或mTOR siRNA干預(yù)細(xì)胞后，胞內(nèi)mTORC1活性被抑制，且LDLr及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SREBP-2、SCAP表達(dá)亦隨之減少。進(jìn)一步研究證實(shí)，炎癥狀態(tài)下mTORC1能夠磷酸化激活細(xì)胞周期蛋白-視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma tumour suppressor protein, Rb)，并增加細(xì)胞內(nèi)活性SREBP-2在細(xì)胞周期S期

11、的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)LDLr基因轉(zhuǎn)錄。3）應(yīng)用微炎癥模型觀察對(duì)肝損傷的影響，結(jié)果證實(shí)，炎癥能夠誘導(dǎo)脂質(zhì)從血液循環(huán)向肝臟組織內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，而雷帕霉素能夠明顯減少肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積;炎癥顯著增加肝臟細(xì)胞LDLr表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控元件SREBP-2及SCAP表達(dá)亦顯著增加，而轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)因子前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertasesubtilisin kexin type9，PCSK9)表達(dá)則減少;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，炎癥誘導(dǎo)

12、的LDLr表達(dá)失調(diào)與mTORC1通路激活密切相關(guān)，炎癥能夠誘導(dǎo)mTORC1通路激活，而雷帕霉素或mTOR siRNA干預(yù)后，胞內(nèi)mTORC1活性明顯降低，且LDLr、SREBP-2及SCAP表達(dá)亦隨之減少，而PCSK9表達(dá)增多。
　　結(jié)論:
　　1、微炎癥狀態(tài)下，ESRD患者AS進(jìn)展加速，其機(jī)制與炎癥誘導(dǎo)mTOR通路激活，破壞LDLr負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇攝入增加，促進(jìn)FC形成有關(guān)。
　　2、體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)，炎

13、癥狀態(tài)下mTORC1磷酸化激活細(xì)胞周期蛋白R(shí)b，可能通過(guò)大量增加細(xì)胞內(nèi)活性SREBP-2在細(xì)胞周期S期的表達(dá)，啟動(dòng)LDLr的基因轉(zhuǎn)錄，從而破壞LDLr負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積增多，進(jìn)而演變?yōu)镕C，加速AS進(jìn)展。
　　3、肝臟作為膽固醇代謝的重要器官，mTORC1通路激活參與炎癥介導(dǎo)的LDLr轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)LDLr表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞對(duì)膽固醇攝取增多，最終促進(jìn)肝臟損傷。
　　4、本研究闡明了炎癥介導(dǎo)的