microRNA-17家族靶向TGFβR2調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌耐藥和轉(zhuǎn)移的初步研究.pdf

1、背景：
　　近30年來肺癌的發(fā)病率、死亡率逐漸上升，肺癌已經(jīng)取代肝癌成為世界上惡性腫瘤死亡原因的第一位。目前，對于肺癌來說最有效的治療手段仍然是手術(shù)治療，無法行手術(shù)治療的肺癌患者只能接受藥物化療或者放射治療。然而患者即使一開始對化療非常敏感，化療一定時間后也會出現(xiàn)化療耐藥，而且控制不了的腫瘤會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，這就是肺癌患者高死亡率的重要原因。
　　在非小細(xì)胞肺癌中MicroRNAs(miRNAs)已經(jīng)被證明在腫瘤化療耐藥和轉(zhuǎn)移的過

2、程中扮演者重要的角色。TGFβ信號通路的異常在惡性腫瘤中顯而易見，而這種異常通常都伴隨著腫瘤的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移。在本課題前期的研究中， miR-17,20a,20b被檢測出相對于A549（順鉑敏感細(xì)胞）在A549/DDP(順鉑耐藥細(xì)胞)中低表達。而在A549/DDP中高表達這3個miRNA會使之EMT狀態(tài)變化從而使之對順鉑重新敏感還有減少細(xì)胞轉(zhuǎn)移。miR-17,20a,20b起碼有一部分功能是通過直接靶向和抑制 TGF?信號通路的重要基

3、因 TGF-beta receptor2(TGFβR2)來起作用。因此我們猜測在非小細(xì)胞肺癌中miRNA17家族（miR-17,20a,20b屬于miRNA17家族）能抑制TGFβR2從而逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥和抑制轉(zhuǎn)移。
　　目的：
　　尋找可以檢測腫瘤順鉑敏感性和腫瘤轉(zhuǎn)移能力強弱的標(biāo)志物miRNA，并研究這些miRNA發(fā)揮作用的分子機制，為尋找預(yù)測順鉑治療敏感性和轉(zhuǎn)移能力強弱的標(biāo)志物提供實驗數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1.

4、體外細(xì)胞株，包括A549和它的耐藥細(xì)胞株A549/DDP。
　　2.miRNA基因芯片檢測 miRNA的表達，miRNA的表達結(jié)果進一步用qRT-PCR驗證。
　　3.細(xì)胞毒性試驗：CCK-8細(xì)胞毒性試驗用來檢測轉(zhuǎn)染了miRNA后細(xì)胞的生存狀況，然后轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞存活率對比。
　　4.生物信息學(xué)軟件預(yù)測miRNA的靶基因。
　　5.在轉(zhuǎn)染miRNA后利用qRT-PCR和Westrn blotting來驗證靶基因的

5、mRNA和蛋白表達。
　　6.用雙熒光素酶試驗檢測miRNA17,20a,20b是否直接靶向TGF?R2。
　　7.用transwell實驗來檢測細(xì)胞的遷移能力。
　　8.利用小干擾RNA(siRNA) si-TGF?R2沉默TGF?R2后檢測其mRNA和蛋白還有其順鉑耐藥性。
　　9.用免疫組化在人體組織中檢測E-cadherin和Vimentin的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR結(jié)果

6、顯示: mir-17，20a，20b的表達在耐藥株細(xì)胞 A549/DDP較非耐藥株細(xì)胞A549中顯著降低，與芯片結(jié)果相符合。
　　2.CCK-8試劑盒檢測顯示：A549/DDP轉(zhuǎn)染mir-17，20a，20b的模擬物后，對順鉑的敏感性增加；而A549轉(zhuǎn)染mir-17，20a，20b抑制物后，變得對順鉑耐藥。
　　3.細(xì)胞形態(tài)：A549表現(xiàn)出表皮細(xì)胞的型態(tài)但A549轉(zhuǎn)染了mir-17，20a，20b抑制物后逐漸變成了間質(zhì)細(xì)胞形

7、態(tài)；而 A549/DDP表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)， A549/DDP轉(zhuǎn)染了mir-17，20a，20b的模擬物后細(xì)胞變成了表皮細(xì)胞形態(tài)。
　　4.用RT-PCR和Western blotting檢測mRNA和蛋白的表達情況：A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染了miR-17,20a,20b模擬物后 Vimentin的表達下降而 E-cadherin的表達增加； A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染了miR-17,20a,20b的抑制物后Vimentin的表達上升，而E

8、-cadherin的表達下降。而且這種情況mRNA和蛋白的結(jié)果是一致的。
　　5.同 transwell實驗我們發(fā)現(xiàn) A549/DDP的遷移能力超過 A549細(xì)胞。在A549/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-17,20a,20b模擬物后細(xì)胞的遷移能力下降，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染了miR-17,20a,20b的抑制物后細(xì)胞的遷移能力上升。這也表明miR-17,20a,20b能夠在非小細(xì)胞肺癌中有效地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移。
　　6.我們發(fā)現(xiàn)在 A549

9、/DDP中TGF?R2無論 mRNA還是蛋白的表達都比A549高，在 A549/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-17,20a,20b模擬物后 TGFβR2的mRNA、蛋白表達都下降；而A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染了miR-17,20a,20b的抑制物TGFβR2的mRNA、蛋白反而上升。
　　7.通過生物信息學(xué)軟件，我們發(fā)現(xiàn)miR-17,20a,20b的潛在靶點TGFβR2。8.分別構(gòu)建帶有野生型和突變型TGFβR2基因的雙熒光素酶報告質(zhì)粒，通過雙

10、熒光素酶報告系統(tǒng)檢測顯示TGF?R2是miR-17,20a,20b的直接靶點。
　　9.利用小干擾RNA（si-RNA）沉默A549/DDP中TGFβR2的表達后，細(xì)胞的EMT狀態(tài)發(fā)生改變，Vimentin的mRNA和蛋白表達下降而 E-cadherin的mRNA和蛋白表達增加，細(xì)胞的遷移能力下降還有細(xì)胞對順鉑重新敏感。
　　10.免疫組化檢測人體組織，原發(fā)癌的E-cadherin的表達比轉(zhuǎn)移癌的高，而轉(zhuǎn)移癌中Vimenti