靶向雙重抑制TBK1和IKKi的新型化合物抗舌癌作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　(1)探討TBK1和IKKi在人舌癌細(xì)胞增殖中的作用，為靶向抑制TBK1和IKKi治療舌癌奠定理論基礎(chǔ)。
　　(2)驗證新型化合物對TBK1和IKKi的抑制能力并評價其體外抗舌癌活性。
　　(3)闡釋TBK1和IKKi雙重抑制化合物對舌癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡和抑制增殖的作用，及其相關(guān)機制。
　　(4)觀察TBK1和IKKi雙重抑制化合物在舌癌荷瘤裸鼠治療效果，探討其抑瘤作用及其發(fā)生機制，為其在舌癌治療中的應(yīng)用

2、提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　(1)常規(guī)培養(yǎng)人舌癌細(xì)胞株SCC-9，SCC-15，SCC-25，Westernblotting檢測TBK1和IKKi及其磷酸化蛋白的表達(dá)情況，采用siRNA干擾技術(shù)分別抑制TBK1或/和IKKi后檢測舌癌細(xì)胞增殖水平。
　　(2)檢測LPS刺激下鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的IRF-3活化水平對化合物的TBK1和IKKi抑制能力進(jìn)行評估，并采用MTT法測定化合物作用下的舌癌細(xì)胞株增殖

3、水平。
　　(3)使用ApopTag原位凋亡檢測試劑盒觀察舌癌細(xì)胞在化合物200A作用下的凋亡現(xiàn)象，Western blotting對化合物200A誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行分析，并探討凋亡機制。
　　(4)建立SCC-9舌癌荷瘤裸鼠模型，應(yīng)用TBK1和IKKi雙重抑制化合物200A進(jìn)行治療，觀察其對裸鼠腫瘤生長的影響及荷瘤裸鼠的毒性反應(yīng)，采用免疫組化、Western blotting、RT-PCR分析化合物200A治療前

4、后腫瘤組織的VEGF，p-AKT表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)三種舌癌細(xì)胞株中均可以檢測到TBK1和IKKi及其磷酸化表達(dá)，p-IKKi的表達(dá)水平高于p-TBK1。siRNA干擾實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，TBK1-siRNA，IKKi-siRNA SCC-25兩組細(xì)胞的增殖水平略有下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但在SCC-25的TBK1和IKKi均被抑制后其增殖水平被顯著抑制，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)

5、。
　　(2) Western blotting發(fā)現(xiàn)三種化合物均能下調(diào)LPS刺激下的RAW264.7細(xì)胞中IRF-3的磷酸化水平，其中200A作用相對較強。MTT法發(fā)現(xiàn)三種化合物對三種舌癌細(xì)胞株均具有較好的抑制作用（IC50介于0.430-1.901μM），其中200A在這三種舌癌細(xì)胞株中具有均衡的、較低的IC50，表現(xiàn)出較高的抗舌癌細(xì)胞增殖活性。
　　(3)形態(tài)學(xué)研究證實TBK1和IKKi雙重抑制化合物可以促進(jìn)舌癌細(xì)胞凋亡

6、，隨著化合物處理時間增長或化合物濃度增高，CleavedCaspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-7及Cleaved PARP蛋白表達(dá)水平逐漸增高。舌癌細(xì)胞在TBK1和IKKi雙重抑制化合物處理后，Cyclin D1、p-AKT、p-CYLD蛋白表達(dá)水平下降。
　　(4)實驗過程中隨著200A腹腔注射時間增長，其對實驗組裸鼠腫瘤生長的抑制效果逐漸加強（圖5-1）。從第22天起，兩組之間

7、腫瘤體積差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），到第31天及之后，兩組之間腫瘤體積差異具有更顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。治療過程中，裸鼠精神狀態(tài)佳，生長發(fā)育、飲食活動均未見明顯異常，表明化合物200A毒性反應(yīng)小。實驗結(jié)束時實驗組的腫瘤重量小于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，瘤重抑制率為56.97％。免疫組化結(jié)果顯示VEGF及p-AKT在實驗組的陽性表達(dá)率明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），RT-PCR和West

8、ern blotting分別驗證了該結(jié)果。
　　結(jié)論:
　　(1) TBK1和IKKi在舌癌細(xì)胞中表達(dá)并活化，IKKi的磷酸化水平高于TBK1，同時抑制它們可有效抑制舌癌細(xì)胞的增殖，表明TBK1和IKKi可成為新型抗舌癌藥物的分子靶點。
　　(2) TBK1和IKKi雙重抑制化合物SR8185、200A和200B具有抑制TBK1和IKKi的能力，且可抑制舌癌細(xì)胞增殖，尤以200A相對最佳，可作為新型抗舌癌藥物的候選化合