DPP-4酶抑制劑對2型糖尿病大鼠腸道緊密連接蛋白ZO-1和occludin的調(diào)控與代謝性內(nèi)毒素血癥的相關(guān)性研究.pdf

1、背景:
　　2型糖尿病是一種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而形成的多基因遺傳性復(fù)雜疾病。近年來發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害了人類的身體健康并急劇加重了社會醫(yī)療成本。目前認(rèn)為系統(tǒng)性（全身性）慢性炎癥在2型糖尿病的發(fā)病機制中發(fā)揮著極其重要的作用。
　　研究證實，腸道革蘭氏陰性桿菌的細(xì)胞壁成分脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的全身系統(tǒng)性炎癥是2型糖尿病、肥胖等代謝性疾病發(fā)病機制中的重要因素。這種循環(huán)中的脂多糖水平較正常值高2-3倍的病理現(xiàn)象被定義為“

2、代謝性內(nèi)毒素血癥”。內(nèi)循環(huán)中增多的LPS不僅可以引起肝臟的炎癥，促進(jìn)肝臟纖維化，還可以導(dǎo)致肌肉、脂肪等組織的炎癥，介導(dǎo)胰島素抵抗的產(chǎn)生。
　　在不良的生活方式如高脂飲食的影響下，脂質(zhì)會在腸上皮間隙過度堆積，破壞腸道緊密連接結(jié)構(gòu)，另外腸道微環(huán)境包括腸道菌群等的改變，還會觸發(fā)腸道炎癥，使得腸屏障功能受損，腸道通透性增加，從而導(dǎo)致LPS入血增多。提示腸黏膜屏障功能的損害是代謝性內(nèi)毒素血癥發(fā)生機制中極其重要的環(huán)節(jié)。
　　在維持腸黏膜

3、屏障正常功能的諸多因素中，緊密連接(TJ)的作用十分重要，其不僅是腸上皮機械屏障的最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞旁物質(zhì)轉(zhuǎn)運的限速步驟。緊密連接(TJ)主要由跨膜蛋白claudin、occludin和膜周蛋白zonulaoccludens(ZO)等組成，主要功能是維持腸上皮細(xì)胞的極性和調(diào)節(jié)腸道屏障的通透性，減少腸道大分子和微生物通過腸壁進(jìn)入機體內(nèi)環(huán)境。
　　益生元、益生菌等調(diào)節(jié)腸道菌群或改善腸道炎癥的手段可以通過減輕2型糖尿病或肥胖

4、大鼠的腸道緊密連接蛋白的損傷，減輕腸道炎癥，減少腸道LPS進(jìn)入機體內(nèi)環(huán)境。改善腸黏膜屏障功能，降低腸道通透性，減少腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)物如脂多糖進(jìn)入血循環(huán)目前被認(rèn)為是改善諸如肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的一種新的治療策略。
　　胰高血糖素樣肽-2(glucagon-likepeptide-2，GLP-2)是腸道L細(xì)胞分泌的一種多肽類物質(zhì)，也是腸上皮特異性生長因子，其促進(jìn)腸黏膜生長的作用明顯強于其他腸上皮生長因子，對損傷的腸道上皮擁有強大

5、的修復(fù)功能，可以明顯上調(diào)腸上皮緊密連接蛋白的表達(dá)，顯著的改善腸黏膜屏障功能。同GLP-1類似，GLP-2也可以被DPP-4酶降解失活。
　　另外有研究表明，在介導(dǎo)代謝性炎癥及胰島素抵抗中擁有極其重要功能的蛋白酶激活受體2(protease activated receptors2，PAR2)，在促進(jìn)腸道炎癥，誘導(dǎo)腸黏膜損傷方面也有著舉足輕重的作用。腸道激活的PAR2不僅可以誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒和激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，促進(jìn)炎性因子

6、的釋放和炎性細(xì)胞的遷移浸潤，引起腸道黏膜的損傷，還可以通過激活胞漿中的ERK1/2，促使腸道緊密連接蛋白和其周圍肌動蛋白的重新分布，增加腸道通透性。
　　使用DPP-4酶抑制劑抑制腸道GLP-2的水解和PAR2的激活，可能會對2型糖尿病大鼠腸黏膜屏障功能起到保護(hù)作用，從而減少腸道LPS入血，減輕代謝性內(nèi)毒素血癥。
　　本研究通過檢測2型糖尿病大鼠近端結(jié)腸緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達(dá)及門靜脈血漿LPS和相關(guān)炎癥

7、因子水平的變化，探討DPP-4酶抑制劑利格列汀對腸黏膜屏障及代謝性內(nèi)毒素血癥的保護(hù)作用及其可能的機制，為挖掘DPP-4酶抑制劑降糖之外的作用、擴展DPP-4酶抑制劑在臨床的應(yīng)用范圍以及治療肥胖及胰島素抵抗等相關(guān)疾病提供新的策略和依據(jù)。
　　方法:
　　30只SPF級雄性SD大鼠，體重在180～200g之間，使用隨機數(shù)字表隨機分為正常對照組(NC組，n=10)和糖尿病組（T2DM組，n=20），正常對照組予普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病

8、組予高脂飼料喂養(yǎng)，第8周末兩組大鼠禁食12 h，糖尿病組大鼠腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，35 mg/kg)2次（間隔7天）進(jìn)行造模，普通飲食組同時腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。第9周末末次注射STZ72 h后，門靜脈取血測空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)，以胰島素抵抗、空腹血糖≥11.1 mmol/L作為T2DM診斷的標(biāo)準(zhǔn)。
　　將造模成功的大鼠按照隨機數(shù)字表隨機分為模型對照組和利格列汀干預(yù)組，利格列汀干預(yù)

9、組予利格列汀3mg/kg/d連續(xù)灌胃4周，模型對照組和正常對照組均給予等體積生理鹽水灌胃，繼續(xù)飼養(yǎng)至13周末。觀察各組大鼠食欲、毛發(fā)、大小便、行為及整體狀態(tài)情況，根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。灌胃藥液均每天配制。末次給藥后，所有大鼠空腹過夜，稱量體質(zhì)量。以10％水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，經(jīng)門靜脈取血，離心取上清，-20℃保存，用于血清學(xué)指標(biāo)的測定;截取近回盲部(＜4cm)的近端結(jié)腸組織，于液氮中速凍，然后-80℃保存;
　　全自動生

10、化儀檢測空腹血糖(Fasting Plasma Glucose，F(xiàn)PG)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Total Cholesterol，TC);酶聯(lián)免疫吸附試驗(EnzymesLinked Immunosorbent Assay，ELISA)法檢測血漿胰島素(Fasting plasmainsulin，F(xiàn)IN)，計算胰島素敏感指數(shù)（Insulin Sensitivity Index，ISI）、胰島素抵抗指數(shù)(

11、Homeostasis model assessment-insulin resistance index,HOMA-IR)。ISI取自然對數(shù)納入統(tǒng)計分析;利用鱟試劑采用終點顯色法嚴(yán)格執(zhí)行無熱原操作檢測血漿LPS含量;ELISA檢測血漿腫瘤壞死因子-α、白介素-6以及二胺氧化酶的含量;免疫印跡法Western blot檢測近端結(jié)腸組織中緊密連接蛋白ZO-1、occludin、胰高血糖素樣肽-2及PAR2的含量。
　　采用SPSS1

12、9.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism6作圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗，若資料符合正態(tài)性、方差齊，多樣本均數(shù)比較采用完全隨機設(shè)計的方差分析，組間比較采用LSD檢驗;方差不齊時多樣本均數(shù)比較采用近似F檢驗的Welch法;組間比較采用非參數(shù)檢驗的Tamhane's T2法;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、高脂飲食9周聯(lián)合2次鏈脲佐菌素腹腔注射（35 mg/kg，間隔7

13、天）成功制備2型糖尿病大鼠模型
　　第9周末次注射STZ72h后糖尿病組有4只大鼠死亡，剩余16只動物全部存活且空腹血糖均大于11.1 mmol/L，胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯降低，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)明顯增高，提示胰島素抵抗明顯，模型制備成功。造模及藥物干預(yù)過程中，正常對照組大鼠活動正常，毛發(fā)整齊。模型對照組大鼠活動減少，精神萎靡，多尿且毛發(fā)暗淡凌亂。
　　2、2型糖尿病大鼠腸道緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)，腸黏膜屏

14、障功能受損
　　第13周末，與正常對照組相比，模型對照組大鼠近端結(jié)腸組織緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達(dá)降低(p＜0.01);血漿二胺氧化酶的水平明顯升高(p＜0.01，p＜0.05)，提示2型糖尿病大鼠存在腸黏膜屏障功能受損。
　　3、2型糖尿病大鼠血漿LPS及相關(guān)炎癥因子水平升高，提示成功誘導(dǎo)“代謝性內(nèi)毒素血癥”
　　第13周末，與正常對照組相比，模型對照組門靜脈血漿脂多糖(LPS)的水平明顯上升(p＜

15、0.01)，血漿腫瘤壞死因子-α和白介素-6的表達(dá)均明顯升高(p＜0.01)。
　　4、DPP-4酶抑制劑利格列汀對2型糖尿病大鼠糖脂水平、胰島素抵抗及體重的影響
　　第13周與正常對照組相比，模型對照組大鼠空腹血糖、空腹血漿胰島素、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、血漿甘油三酯及總膽固醇等指標(biāo)明顯增高(p＜0.01，p＜0.05)，胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯降低(p＜0.01)，體重也有明顯增加(p＜0.01)
　

16、　經(jīng)過利格列汀4周的干預(yù)，與模型對照組相比，利格列汀干預(yù)組大鼠空腹血糖、空腹血漿胰島素、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、血漿甘油三酯及總膽固醇等指標(biāo)水平均顯著降低(p＜0.01)，胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯升高(p＜0.01)。但對體重?zé)o明顯影響(p＞0.05)。
　　5、DPP-4酶抑制劑利格列汀對2型糖尿病大鼠腸黏膜屏障功能和代謝性內(nèi)毒素血癥的影響
　　經(jīng)過利格列汀4周的干預(yù)，與模型對照組相比，利格列汀干預(yù)組大鼠近端

17、結(jié)腸組織緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達(dá)上升(p＜0.01);血漿二胺氧化酶的水平也有所降低(p＜0.01)。大鼠門靜脈血漿脂多糖(LPS)的水平下降(p＜0.01)，血漿腫瘤壞死因子-α和白介素-6的表達(dá)均有明顯降低(p＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、高脂飲食聯(lián)合STZ成功制備了2型糖尿病大鼠模型。
　　2、制備的2型糖尿病大鼠模型腸道緊密連接蛋白表達(dá)下降，腸黏膜屏障受損，可以很好的模擬2型糖尿病代謝