內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控乙酰肝素酶表達(dá)的機(jī)制及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響.pdf

1、目的：⑴研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress response，ER stress）狀態(tài)對(duì)人乳腺細(xì)胞MDA-MB-231和MDA-MB-435侵襲遷移的影響。⑵研究ER stress對(duì)乳腺癌細(xì)胞中乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）表達(dá)及活性的影響。⑶探討是否可通過(guò)肝素酶抑制劑OGT2115和低分子量肝素（Low molecular weight heparin，LMWH）抑制Hpa而調(diào)控ER

2、stress對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響。⑷檢測(cè)ER stress狀態(tài)下侵襲遷移相關(guān)蛋白的變化，探討參與ER stress調(diào)控Hpa的機(jī)制。
　　方法：①以侵襲能力較強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-435為研究對(duì)象，使用化療藥物阿霉素（adriamycin，ADM）和ER stress經(jīng)典誘導(dǎo)劑衣霉素（tunicamycin， TM）誘導(dǎo)細(xì)胞ER stress，不同濃度ADM作用于乳腺癌細(xì)胞24h、48h、72 h

3、后使用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性，并據(jù)此選擇對(duì)細(xì)胞增殖影響較小的濃度進(jìn)行接下來(lái)的侵襲遷移實(shí)驗(yàn)。②以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MDA-MB-435為對(duì)象，ADM和TM處理一段時(shí)間后Western blot檢測(cè)ER stress標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)。③使用Transwell法檢測(cè)ADM和TM對(duì)兩株乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移能力。同時(shí)使用Western blot、ELISA法檢測(cè)ADM、TM刺激乳腺

4、癌細(xì)胞后Hpa表達(dá)活性的變化。④使用肝素酶抑制劑OGT2115/LMWH后，Transwell法再次檢測(cè)ER stress狀態(tài)下兩株細(xì)胞的侵襲和遷移的變化；ELISA法檢測(cè)Hpa的變化以及Western blot檢測(cè)ER stress時(shí)侵襲遷移相關(guān)蛋白如基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP） MMP-9，IκB-α和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（epithelial-mesenchymal transition，

5、EMT）蛋白的變化。
　　結(jié)果：⑴MTT結(jié)果顯示，ADM能明顯抑制兩株乳腺癌細(xì)胞的增殖，抑制活性隨著作用時(shí)間和劑量的增加而增加；選用對(duì)細(xì)胞增殖影響較小濃度的ADM和TM進(jìn)行Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度如ADM（0.2μmol·L-1）和TM（0.75μmol· L-1）一定程度上可以增加乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移（p<0.05）。⑵ADM（0.2μmol·L-1）作用于乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)

6、胞24h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化療藥物ADM可以引起ER stress，6h即可檢測(cè)到標(biāo)志蛋白GRP78表達(dá)明顯升高。TM作為經(jīng)典誘導(dǎo)劑，TM（0.75μmol·L-1）作用于兩株乳腺癌細(xì)胞后，Western blot檢測(cè)GRP78明顯升高，驗(yàn)證了TM誘導(dǎo)ER stress的能力。ADM和TM刺激兩株乳腺癌細(xì)胞24h、36h后，Western blot和ELISA法檢測(cè)Hpa的表達(dá)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)ER stress

7、可激活Hpa，16h和24h時(shí)Hpa明顯升高，繼而引起了一系列侵襲遷移的后效應(yīng)。⑶考慮到Hpa在ER stress增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的過(guò)程中可能起著關(guān)鍵作用，我們使用Hpa本身活性抑制劑OGT2115以觀察其是否可以抑制ER stress引起的細(xì)胞侵襲遷移。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OGT2115對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用不強(qiáng)，但和ADM聯(lián)合后不會(huì)減弱ADM的抗腫瘤增殖作用。ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)OGT2115可以抑制Hpa活性，并且可以明顯抑

8、制被ADM/TM激活的Hpa活性，OGT2115（0.8μmol·L-1）單獨(dú)作用于乳腺癌細(xì)胞后可以輕度抑制細(xì)胞侵襲遷移，并且可以能明顯減少由ER stress引起的細(xì)胞侵襲遷移（p<0.05）。⑷使用Hpa的另一類(lèi)抑制劑肝素類(lèi)似物L(fēng)MWH進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，MTT檢測(cè)LMWH可以輕度抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，抑制活性隨著作用時(shí)間和劑量的增加而增加。ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)LMWH能明顯抑制由ADM/TM激活的Hpa活性，使用LMWH（500 IU

9、·ml-1）可以明顯減少ADM（0.2μmol·L-1）/TM（0.75μmol· L-1）引起的細(xì)胞侵襲遷移（p<0.05），結(jié)果與OGT2115的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。⑸通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可知，Hpa在ER stress增加乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的過(guò)程中有重要的作用，Hpa的表達(dá)受到很多因素的影響，Western blot檢測(cè)可知TM（0.75μmol· L-1）刺激乳腺癌細(xì)胞24h后MMP-9升高，IκB-α降低，NF-κB被激活，EMT蛋白E-

10、cadherin降低、β-catenin降低、vimentin升高，提示可能誘導(dǎo)出現(xiàn)了EMT。使用Hpa抑制劑可以對(duì)EMT蛋白進(jìn)行調(diào)控，這提示我們EMT相關(guān)通路可能參與了ER stress激活Hpa的過(guò)程。
　　結(jié)論：①相關(guān)濃度化療藥物ADM、TM促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435細(xì)胞侵襲和遷移，這與化療藥物誘導(dǎo)的ER stress保護(hù)細(xì)胞作用過(guò)度激活了Hpa密切相關(guān)。②通過(guò)抑制Hpa可以減少由ER stress