丙戊酸鈉對阿霉素體外抗乳腺癌作用的影響及其與縫隙連接通訊之間的關(guān)系.pdf

1、目的：⑴觀察丙戊酸鈉（Valproate acid sodium, VPA）對乳腺癌Hs578T細(xì)胞縫隙連接功能（gap junction, GJ）的影響及其對阿霉素（Adriamycin, ADM）體外抗腫瘤作用的影響。⑵探討丙戊酸鈉改變GJ功能的可能機(jī)制。
　　方法：①MTT法檢測VPA對Hs578T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。②細(xì)胞接種熒光示蹤法檢測VPA對Hs578T細(xì)胞GJ功能的影響。③MTT法檢測ADM對Hs578T細(xì)胞的細(xì)胞毒性

2、。④用不同密度接種細(xì)胞的方法，獲得生長融合細(xì)胞（細(xì)胞之間有緊密接觸，有條件形成GJ）與生長未融合細(xì)胞（細(xì)胞之間無接觸，無條件形成GJ），在上述不同密度接種的細(xì)胞，采用MTT法觀察5mM VPA對ADM的細(xì)胞毒性的影響。為了進(jìn)一步驗證在有GJ形成的條件下，VPA對ADM細(xì)胞毒性的影響，我們采用MTT法檢測不同濃度的VPA（0、2.5、5、10 mM）作用Hs578T細(xì)胞24 h后，對ADM的細(xì)胞毒性的影響和5 mM VPA作用Hs578T

3、細(xì)胞不同時間（0、6、12、24 h)，對ADM的細(xì)胞毒性的影響。⑤用不同密度接種細(xì)胞的方法，獲得生長融合細(xì)胞（細(xì)胞之間有緊密接觸，有條件形成GJ）與生長未融合細(xì)胞（細(xì)胞之間無接觸，無條件形成GJ），在上述不同密度接種的細(xì)胞，采用Annexin V/PI雙染法觀察5 mM VPA對ADM誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡作用的影響。實驗觀察5 mM V PA預(yù)處理Hs578T細(xì)胞24 h，再用1μM ADM處理Hs578T細(xì)胞8 h，ADM誘導(dǎo)的細(xì)胞早期

4、凋亡率的變化。⑥在有GJ形成的條件下采用Hochest33258熒光染色法檢測5 mM VPA處理Hs578T細(xì)胞24 h，對ADM誘導(dǎo)細(xì)胞晚期凋亡作用的影響。⑦Western Blotting檢測不同濃度的VPA（0、1.25、2.5、5 mM）處理Hs578T細(xì)胞24 h，對細(xì)胞Cx43總蛋白表達(dá)的影響。此外，在此實驗中進(jìn)一步采用 Western Blotting觀察5 mM VPA處理Hs578T細(xì)胞不同時間（0、6、12、24

5、h）后，對細(xì)胞Cx43總蛋白表達(dá)的影響。⑧細(xì)胞免疫熒光法檢測不同濃度的VPA（0、0.625、1.25、2.5、5 mM）處理Hs578T細(xì)胞24 h，對細(xì)胞表面Cx43蛋白表達(dá)的影響。此外，在此實驗中進(jìn)一步采用細(xì)胞免疫熒光法檢測5 mM VPA處理Hs578T細(xì)胞不同時間（0、6、12、24 h）后，對細(xì)胞表面Cx43蛋白表達(dá)的影響。⑨Western Blotting檢測不同濃度的VPA（0、0.625、1.25、2.5、5、10 m

6、M）處理Hs578T細(xì)胞24 h，對細(xì)胞Src激酶表達(dá)的影響。此外，在此實驗中進(jìn)一步采用 Western Blotting檢測5 mM VPA處理Hs578T細(xì)胞不同時間（0、6、12、24 h）后，對細(xì)胞Src激酶表達(dá)的影響。⑩熒光接種示蹤法檢測不同濃度的PP2（0、1、2、4、8μM）處理Hs578T細(xì)胞24 h，對細(xì)胞GJ功能的影響。此外，在此實驗中進(jìn)一步采用熒光接種示蹤法檢測8μM PP2處理Hs578T不同時間（0、6、12、

7、24 h），對細(xì)胞GJ功能的影響。
　　結(jié)果：⑴MTT檢測結(jié)果顯示VPA在0～10 mmol/L的濃度范圍內(nèi)并不影響細(xì)胞存活率。細(xì)胞接種熒光示蹤結(jié)果顯示VPA（1.25～5 mmol/L）處理Hs578T細(xì)胞24 h，可以顯著增強(qiáng)GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間熒光傳遞（P<0.01）。與對照組相比，VPA處理后細(xì)胞的熒光傳遞功能分別增加了40.12％、110.23%、140.13%和160.34%；5 mmol/L丙戊酸鈉處理Hs578T細(xì)胞不

8、同時間（6 h、12 h和24 h）可以顯著增強(qiáng)GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間熒光傳遞（P<0.01）。與對照組相比，VPA預(yù)處理不同時間后細(xì)胞的熒光傳遞功能分別增加了70.06%、110.26%和160.31%。結(jié)果表明，在Hs578T細(xì)胞中VPA可以顯著增強(qiáng)GJ功能。推測，在Hs578T細(xì)胞中VPA可以增強(qiáng)ADM的體外抗腫瘤作用。⑵MTT檢測結(jié)果顯示ADM（0.5、1、2、4、8μmol/L）作用Hs578T細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率分別為91.1

9、2%、79.15%、70.01%、50.07%和46.23%。MTT法檢測結(jié)果顯示在高密度接種（有GJ形成）條件下，用5 mM VPA增強(qiáng)GJ功能后，8μM ADM處理Hs578T細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率顯著低于8μM ADM單用組（P<0.01）；而在低密度接種（無GJ形成）條件下，用5 mM VPA預(yù)處理組的細(xì)胞存活率與8μM ADM單用組相比無顯著差別（P>0.05）。同時 MTT檢測結(jié)果顯示在細(xì)胞融合的條件下，VPA（2.5、5

10、、10 mM）預(yù)處理Hs578T細(xì)胞24 h，1μM ADM作用細(xì)胞24 h后的細(xì)胞存活率都顯著高于ADM單用組（P<0.01）。并且 MTT檢測結(jié)果顯示在細(xì)胞融合的條件，隨著5 mM V PA預(yù)處理時間的延長，可以顯著增強(qiáng)ADM的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，在Hs578T細(xì)胞中VPA可以通過增強(qiáng)GJ功能而顯著增強(qiáng)ADM的細(xì)胞毒性。⑶Annexin V/PI雙染結(jié)果顯示在高密度接種（有GJ形成）條件下，用5 mM VPA增強(qiáng)GJ功能后，1μM

11、ADM處理Hs578T細(xì)胞8 h，細(xì)胞早期凋亡率顯著高于1μM ADM單用組（P<0.01）；而在低密度接種（無GJ形成）條件下，用5 mM VPA預(yù)處理組誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡率與1μM ADM單用組相比無顯著差別（P>0.05）。Hochest33258熒光染色結(jié)果顯示在有GJ形成的Hs578T細(xì)胞中，用5 mM VPA增強(qiáng)GJ功能后，1μM ADM作用Hs578T細(xì)胞24 h，細(xì)胞晚期凋亡率顯著高于1μM ADM單用組（P<0.01）

12、；單用VPA組對細(xì)胞凋亡無影響。結(jié)果表明，在Hs578T細(xì)胞中VPA可以通過增強(qiáng)GJ功能而顯著增強(qiáng)ADM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。⑷Western blotting結(jié)果顯示VPA（1.25～5 mmol/L）處理Hs578T細(xì)胞24 h，可以顯著增強(qiáng)Cx43總蛋白的表達(dá)（P<0.01）；5 mmol/L VPA預(yù)處理Hs578T細(xì)胞6 h、12 h和24 h，可以顯著增強(qiáng)Cx43總蛋白的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示VPA（1.25～5 mmol

13、/L）作用Hs578T細(xì)胞24 h，可顯著增強(qiáng)細(xì)胞胞膜Cx43蛋白的表達(dá)；5 mM VPA預(yù)處理Hs578T細(xì)胞6 h、12 h和24 h，可顯著增強(qiáng)胞胞膜Cx43蛋白的表達(dá)。 Western blotting結(jié)果顯示VPA（0.625、1.25、2.5、5、10 mM）處理Hs578T細(xì)胞24 h，可以顯著降低Src激酶的表達(dá)（P<0.01）；5 mM預(yù)處理Hs578T細(xì)胞6 h、12 h和24 h，可以顯著降低Src激酶的表達(dá)（P<

14、0.01）。提示，VPA可以通過增強(qiáng)Hs578T細(xì)胞Cx43總蛋白的表達(dá)和胞膜Cx43的表達(dá)而增強(qiáng)細(xì)胞GJ功能；也可能通過抑制Src激酶表達(dá)而增強(qiáng)GJ功能。MTT檢測結(jié)果顯示PP2在0～10 mmol/L的濃度范圍內(nèi)并不影響細(xì)胞存活率。細(xì)胞接種熒光示蹤結(jié)果顯示PP2（1～8μmol/L）處理Hs578T細(xì)胞24 h，可以顯著增強(qiáng)GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間熒光傳遞（P<0.01）。與對照組相比，PP2處理后細(xì)胞的熒光傳遞功能分別增加了60.12%、

15、100.24%、120.14%和170.21%；8μmol/L PP2預(yù)處理Hs578T細(xì)胞6 h、12 h和24 h，可以顯著增強(qiáng)GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間熒光傳遞功能（P<0.01)。與對照組相比，VPA預(yù)處理不同時間后細(xì)胞的熒光傳遞功能分別增加了41.21%、70.23%和122.13%。提示，在Hs578T細(xì)胞中PP2可以顯著增強(qiáng)GJ功能。Western blotting結(jié)果顯示PP2（1～8μmol/L）處理Hs578T細(xì)胞24 h，可

16、以顯著降低Src激酶的表達(dá)（P<0.01）；8μmol/L PP2預(yù)處理Hs578T細(xì)胞6 h、12 h和24 h，可以顯著降低Src激酶的表達(dá)（P<0.01）。PP2（1～8μmol/L）處理Hs578T細(xì)胞24 h，對Cx43蛋白的表達(dá)無顯著影響（P>0.05）。提示，在Hs578T細(xì)胞中抑制Src激酶表達(dá)可以顯著增強(qiáng)GJ功能。
　　結(jié)論：①在Hs578T細(xì)胞中VPA可以通過增強(qiáng)細(xì)胞GJ功能而顯著增強(qiáng)ADM的細(xì)胞毒性。②在Hs