人ndrg2兩亞型基因原核表達載體的構(gòu)建及蛋白的表達、純化與抗腫瘤作用的研究.pdf

1、人ndrg2(N-myc downstream regulated gene 2)基因是本課題組用消減雜交法從人腦內(nèi)克隆得到的一個抑癌候選基因，已被Gen Bank收錄，登錄號為AF159092。它定位于染色體14q11.1-11.2，具有兩個亞型，分別編碼含有357個氨基酸殘基和含有371個氨基酸殘基、分子量約為43kDa的蛋白質(zhì)。ndrg2為Ndrg基因家族成員之一，該家族成員有4個：ndrg1，ndrg2，ndrg3，ndrg4，

2、且該基因家族成員的氨基酸組成在從低等生物到高等生物的進化中有相當高的保守性，以上提示該基因家族在細胞的生命過程起著重要作用。本課題組初步研究結(jié)果顯示，該基因在多種正常組織中高表達，而在某些腫瘤組織和腫瘤細胞系中低表達或無表達，比如發(fā)現(xiàn)該基因在肺癌和肝癌中的表達明顯低于相應的癌旁組織，還發(fā)現(xiàn)該基因在體外可抑制多種腫瘤細胞系的生長，如瞬時轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系BT325具有抑制細胞增殖的功能，推測該基因可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，因此提出ndrg2

3、可能為新的候選抑癌基因。但其作用的具體機制尚不清楚。
　　首先，本課題構(gòu)建了兩種人ndrg2亞型原核重組體pPROEX-HTb-ndrg2并進行表達、純化、濃縮和鑒定。根據(jù)人ndrg2基因序列設計合成特異引物，PCR擴增，亞克隆入6×His融合表達載體pPROEX-HTb，在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導融合蛋白的表達，并用Protino Ni-TED Resin進行純化。試驗結(jié)果表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后分別可見約1100bp

4、大小的片段，與預期結(jié)果一致，基因測序結(jié)果表明序列正確。在IPTG的誘導下重組體分別表達出分子量約45kd(含多克隆位點及His標簽)的表達產(chǎn)物，Western blot結(jié)果證實重組6×His融合蛋白可與抗-ndrg2蛋白抗體發(fā)生特異性反應；并通過Protino Ni-TED Resin成功獲得了純化蛋白。通過本試驗，兩種人ndrg2亞型基因分別被亞克隆至6×His融合表達載體pPROEX-HTb中，并獲得成功表達和純化，為該蛋白的生物活

5、性及抑瘤作用的研究奠定了基礎。
　　其次，本課題對純化的ndrg2-357以及ndrg2-371兩種蛋白進行抑制腫瘤作用活性的檢測。首先我們大量誘導表達ndrg2-357以及ndrg2-371兩種蛋白，并采用Protino Ni-TED Resin進行純化，采用超濾離心管進行蛋白的濃縮以及蛋白緩沖液的替換，定量后進行體外試驗檢測其對膠質(zhì)瘤U251、BT325及肺腺癌A549等腫瘤細胞的抑制作用，觀察ndrg2-371蛋白的抗腫瘤活