血小板蛋白酶活化受體-1激活后下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞miR-200b的表達(dá).pdf

1、目的:
　　 結(jié)直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)，其死亡率在惡性腫瘤中排第四位。在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年增高趨勢(shì)。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤致死的主要原因。結(jié)直腸癌是一類上皮來源的惡性腫瘤。越來越多的研究顯示，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)是上皮來源腫瘤轉(zhuǎn)移的首要步驟。
　　 微小RNA是一類近十年來備受關(guān)注的廣泛存在于真核生物及病毒中的非編碼小

2、分子RNA，其大小約22個(gè)核苷酸。成熟的微小RNA通過與靶mRNA的3'端非編碼區(qū)完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而miR-200家族是一類重要的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)調(diào)控因子，TGF-β1和ZEB1/2是其重要的靶基因。
　　 臨床上發(fā)現(xiàn)，晚期結(jié)直腸癌患者往往合并血小板增多癥。早期研究發(fā)現(xiàn)，血小板也能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。最新研究顯示，血小板通過TGF-β1途徑參

3、與了EMT的發(fā)生。眾所周知，血小板α顆粒富含TGF-β1，而PAR1是人血小板表面的一種蛋白酶活化受體，血小板PAR1激活后α顆?？赡茚尫糯罅考?xì)胞因子（如TGF-β1）影響腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移。
　　 血小板和miR-200家族均可通過TGF-β1途徑影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。而它們兩者在調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移過程中是否存在關(guān)聯(lián)在國內(nèi)外罕有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR、MTT、ELISA等方法探討血小板蛋白酶活化受體-1以PAR1激動(dòng)劑（TFL

4、LR-NH2）激活后對(duì)SW620細(xì)胞miR-200b表達(dá)水平的影響，旨在為結(jié)盲腸痛治療提供新的依據(jù)。
　　 方法:
　　 1以不同濃度(1μM、3μM、5μM、7μM、9μM、30μM)的PAR1激動(dòng)劑（TFLLR-NH2）處理SW620，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組（單純加細(xì)胞培養(yǎng)液），在溫箱中孵育24h后，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞，比較各組細(xì)胞增殖功能的變化。
　　 2應(yīng)用ELISA法對(duì)不同濃度(1μM、3μM、5μM

5、、7μM、9μM)PAR1激動(dòng)劑(TFLLR-NH2)激活的血小板上清的TGF-β1進(jìn)行定量分析。
　　 3以3μM濃度的PAR1激動(dòng)劑（TFLLR-NH2）激活人血小板后，提取血小板上清，設(shè)定4個(gè)處理組，分別取不同體積量(60μl、120μl、240μl、480μl)的血小板上清處理6孔板中的SW620細(xì)胞，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組及單純激動(dòng)劑組，空白對(duì)照組單純加細(xì)胞培養(yǎng)液，單純激動(dòng)劑組加入0.72μMPAR1激動(dòng)劑，存溫箱中分別孵

6、育24h及48h后，利用TRIZOL法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用基于2(-△△Ct)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法對(duì)各組miR-200b的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果:
　　 1MTT結(jié)果顯示，小劑量各個(gè)不同濃度(1μM、3μM、5μM、7μM、9μM)PAR1激動(dòng)劑處理組和對(duì)照組在492nm下測(cè)得的OD值分別為0.321±0.015、0.314±0.024、0.308±0.015、0.321±0.027

7、、0.313±0.012、0.302±0.024、各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;大劑量濃度(30μM)PAR1激動(dòng)劑處理組所測(cè)得的OD值為0.203±0.008，較對(duì)照組相比降低了32.9％(P＜0.01)。
　　 2ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組及各個(gè)不同濃度(1μM，3μM，5μM，7μM,9μM)PAR1激動(dòng)劑處理組在450nm下測(cè)得代表TGF-β1含量的OD值分別為0.084±0.003、0.121±0.007

8、、0.322±0.010、0.496±0.010、0.508±0.005、0.516±0.003。各個(gè)處理組TGF-β1含量較對(duì)照組均升高，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)煮義(P＜0.01);7μM與9μM處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 3血小板上清處理SW620細(xì)胞24h后，空白對(duì)照組和單純激動(dòng)劑組SW620細(xì)胞miR-200b的相對(duì)表達(dá)量2-△△CT值分別為0.117±0.007、0.113±0.002;而48h后，這兩組

9、的值分別為0.052±0.001、0.046±0.005。兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4血小板上清處理SW620細(xì)胞24h后，各個(gè)處理組(60.μl、120μl，240μl、480μl)及對(duì)照組SW620細(xì)胞miR-200b的相對(duì)表達(dá)量2-△△CT值分別為0.118±0.013、0.105±0.006、0.095±0.001、0.080±0.013、0.117±0.007。血小板PAR-1激活后的血小板上清

10、60μl、120μl處理組與空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而血小板上清量為240μl，480μl處理組中miR-200b的表達(dá)水平較空白對(duì)照組均降低(P＜0.05)，并且隨著血小板上清量的增加，SW620細(xì)胞miR-200b的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。而血小板上清處理SW620細(xì)胞48h后，所有組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1小劑量濃度(1μM、3μM、5μM、7μM、9μM)的P