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文檔簡介
1、目的:基因異常甲基化在多種疾病發(fā)生發(fā)展機制中有著重要的作用。本研究旨在探討 miR-200b發(fā)生甲基化程度不同及其表達量的差異對于胃癌細胞MGC-803、BGC-823增殖、侵襲、凋亡及對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的影響。
方法:本研究以正常人胃粘膜上皮細胞(GES-1)和胃癌細胞(MGC-803、BGC-823)為研究對象,miR-200b為研究指標。首先提取正常未處理人正常胃粘膜上皮細胞GES-1及胃癌MGC-803、BGC-823
2、細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄之后進行實時熒光定量 PCR(RT-PCR)法檢測 miR-200b在三種細胞中表達的差別,而miR-200b啟動子區(qū)甲基化水平通過亞硫酸氫鈉修飾的PCR(BSP)法進行檢測。其次,對MGC-803、BGC-823細胞進行不同濃度和不同時間點的去甲基化處理,即使用濃度為2.5、5.0、7.5、10μM的5氮雜胞苷(5’-Aza-CdR)處理細胞,每24h換液一次作用72小時后,用RT-PCR法檢測miR-200b的表
3、達量變化, BSP法檢測miR-200b啟動子區(qū)甲基化水平的差異。根據(jù)表達量的差異及甲基化的程度選擇合適的藥物處理濃度。最后,使用最合適的藥物濃度(10μM)作用MGC-803、BGC-823細胞72h, transwell實驗檢測細胞侵襲能力,流式細胞計術檢測細胞周期及凋亡的情況。Western Blot檢測受miR-200b表達量差異影響的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關指標的變化。
結(jié)果:正常胃粘膜上皮細胞(GES-1)中mi
4、R-200b的表達量較高于胃癌細胞 MGC-803、BGC-823,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而miR-200b啟動子區(qū)甲基化水平則與之相反, MGC-803、BGC-823細胞系均較高于GES-1,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。選用不同濃度5’-Aza-CdR藥物處理細胞,兩種胃癌細胞系 miR-200b的表達量有隨著藥物濃度逐漸升高的趨勢,而濃度為10μM時miR-200b啟動子區(qū)甲基化水平較空白對照組降低,差異有統(tǒng)計學
5、意義(P<0.05)。Transwell實驗表明,處理組的胃癌細胞其侵襲能力較對照組明顯減弱(P<0.05)。流式細胞術表明實驗組較對照組細胞周期進展減慢,主要停留在G1期而S期細胞數(shù)相對減少(P<0.01)。與對照組相比實驗組細胞晚期凋亡數(shù)量稍稍增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western Blot實驗表明,在表皮粘膜細胞中表達量較高的E-cadherin實驗組較對照組表達量升高,而在間質(zhì)細胞中表達量較高的N-cadheri
6、n,ZEB1,Slug,MMP9實驗組較對照組表達量降低,即實驗組細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)程度降低。
結(jié)論:MiR-200b表達的下降可能在胃癌變過程中起到重要作用,其作用機制可能與miR-200b啟動子區(qū)高度甲基化作用有關。miR-200b啟動子區(qū)存在發(fā)生甲基化的位點并且甲基化程度的不同可以影響其表達量,而miR-200b表達量的差異又與胃癌細胞MGC-803、BGC-823增殖、侵襲能力密切相關。所以抑癌基因啟動子區(qū)發(fā)生
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