IP3介導(dǎo)的鈣信號(hào)在fractalkine誘導(dǎo)小鼠痛覺(jué)過(guò)敏中的機(jī)制探討.pdf

1、第一部分 fractalkine 對(duì)BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度及其胞內(nèi)效應(yīng)的影響
　　 目的:探討fractalkine誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度變化的機(jī)制及其產(chǎn)生的胞內(nèi)效應(yīng)。
　　 方法:不同濃度f(wàn)ractalkine刺激BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡測(cè)定[Ca2+]I的變化；10nM fractalkine孵育BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞0、30、60、120、240min，westernblot測(cè)定P

2、38mapk、p-P38mapk的表達(dá)；10nM fractalkine孵育BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞0、6、12、24h，RT-PCR及Elisa檢測(cè)白介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因水平及蛋白水平的表達(dá)。預(yù)先60s給予fractalkine的受體的拮抗劑anti-CX3CR1和IP3R的拮抗劑2-APB再給予fractalkine，激光共聚焦顯微鏡測(cè)定[Ca2+]I的變化；Westernblot測(cè)定P38mapk、p

3、-P38mapk的表達(dá)；預(yù)先60s給予fractalkine的受體的拮抗劑anti-CX3CR1、IP3R的拮抗劑2-APB和P38mapk的抑制劑再給予fractalkine，Elisa檢測(cè)白介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)。
　　 結(jié)果：fractalkine引起B(yǎng)V-2細(xì)胞[Ca2+]I增加，p-P38mapk及其IL-1β、TNF-α表達(dá)增加；給與fractalkine 受體的拮抗劑anti-C

4、X3CR1、IP3R的拮抗劑2-APB可以抑制fractalkine引起的胞內(nèi)鈣離子濃度的增加，降低p-P38mapk及其IL-1β、TNF-α表達(dá)；給予P38mapk的抑制劑SB203580降低IL-1β、TNF-α表達(dá)。
　　 結(jié)論：fractalkine通過(guò)與小膠質(zhì)細(xì)胞上的CX3CR1 受體結(jié)合，促發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的IP3 鈣信號(hào)，激活P38mapk，引起IL-1β和TNF-α表達(dá)。
　　 第二部分趨化因子fract

5、alkine在熱痛敏中作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:探討趨化因子fractalkine在熱痛敏中的作用。
　　 方法:清潔級(jí)成年雄性昆明小鼠分成五組，側(cè)腦室注射生理鹽水組、fractalkine組、anti-CX3CR1+fractalkine組、2-APB+fractalkine組和SB203580+fractalkine組。側(cè)腦室注射0、30、60、120、240min，測(cè)量昆明小鼠足底的熱痛閾；各組在上述時(shí)間點(diǎn)處死小

6、鼠并取腦組織，western blot 測(cè)定p-P38mapk 及P38mapk的表達(dá)；各組在側(cè)腦室注射0、6、12、24h 時(shí)處死小鼠并取腦組織，Elisa 檢測(cè)IL-1β和TNF-α的表達(dá)；fractalkine組在側(cè)腦室注射0、6、12、24h 時(shí)處死小鼠并取腦組織，熒光定量RT-PCR檢測(cè)IL-1β和TNF-α基因表達(dá)；側(cè)腦室注射fractalkine 4h 時(shí)處死小鼠，免疫熒光檢測(cè)fractalkine作用的靶細(xì)胞。
　

7、　 結(jié)果:1.Fractalkine組注射60、120、240min，昆明小鼠的熱痛閾較其它四組顯著性降低。2.免疫熒光顯示外源性的fractalkine 通過(guò)與小膠質(zhì)細(xì)胞的受體結(jié)合與小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物Iba-1 共染色。3.Fractalkine組IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)較其他四組顯著性增加；fractalkine組側(cè)腦室注射6、12、24h，IL-1β、TNF-α的基因表達(dá)增強(qiáng)。4.注射30、60、120min，frac