動(dòng)物組織中喹諾酮類藥物多殘留檢測方法的研究.pdf

1、喹諾酮類藥物(Qlinolones，QNs)是一類十分重要的人工合成的抗菌藥物，對革蘭氏陰性菌、大多數(shù)革蘭氏陽性菌、衣原體等具有殺滅作用，廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。然而細(xì)菌對該類藥物較易產(chǎn)生耐藥性，耐藥菌株可通過食物鏈向人類傳遞，此外動(dòng)物性食品中ONs殘留也可導(dǎo)致人體內(nèi)敏感細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，該現(xiàn)象已引起了全世界的關(guān)注。目前對動(dòng)物性食品中ONs殘留進(jìn)行監(jiān)測是確保食品安全和人類健康的最后一道防線。本研究建立了動(dòng)物組織中ONs免疫親和色譜柱凈化技術(shù)，

2、并建立了可檢測ONs藥物多殘留的免疫親和-高效液相色譜-熒光檢測法、固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測法和免疫親和色譜-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，為監(jiān)測動(dòng)物性食品中QNs藥物的殘留提供技術(shù)保障。 利用簇特異性的QNs單克隆抗體制備了可同時(shí)凈化麻保沙星(marbofloxacin，MAR)、依諾沙星(enoxacin，ENO)、氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、培氟沙星(pefloxacin，PEF)、

3、諾氟沙星(norfloxacin，NOR)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、洛美沙星(lomefloxacin，LOM)、單諾沙星(danofloxacin，DAN)、恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)、沙拉沙星(sarafloxacin，SAR)、二氟沙星(difloxacin，DIF)、惡喹酸(oxolinic acid，OXO)、氟甲喹(flumequine，F(xiàn)LU)等13種QNs的免疫親和色譜柱。本研究

4、制備的針對喹諾酮類的IAC柱，選用甲醇-PBS(7:3，v/v)作為洗脫溶液；以nmol/mL gel和nmol/mL IgG為單位表示IAC的動(dòng)態(tài)柱容量和絕對柱容量，更能體現(xiàn)IAC的特性。該IAC柱對每種ONs藥物的動(dòng)態(tài)柱容量為3.75～6.67 nmol/mL gel(1425～2135 ng/mL gel)，絕對柱容量分別為0.75～1.33 nmol/mL IgG(285～427 ng/mg IgG)。在上述優(yōu)化的條件下，IAC

5、柱重復(fù)使用12次后，QNs的柱容量仍能達(dá)到初始柱容量的389/0～45％，滿足QNs殘留分析要求。IAC柱重復(fù)使用20次后，藥物的回收率與樣品的凈化效果無明顯變化。 建立了動(dòng)物肌肉、肝臟組織中10種QNs多殘留檢測的免疫親和-高效液相色譜-熒光檢測法。動(dòng)物組織樣品用PBS溶液提取，提取溶液直接進(jìn)行IAC柱凈化，用PBS、水分別洗滌，用甲醇-PBS(7:3，v/v)洗脫。以0.5～100 ng/g的濃度水平添加時(shí)，雞、豬肌肉組織中

6、10種QNs藥物的平均回收率范圍在81.7％～100.4％之間，日內(nèi)變異系數(shù)范圍在2.7％～12.5％之間，日間變異系數(shù)范圍在6.9％～14.3％之間。雞、豬肝臟組織中10種藥物的平均回收率范圍在74.7％～94.8％之間，日內(nèi)變異系數(shù)范圍在3.9％～12.1％之間，日間變異系數(shù)范圍在6.95％～16.8％之間。方法的檢測限均為0.15 ng/g，定量限為0.5 ng/g。 同時(shí)還建立了雞、豬肌肉組織中10種QNs多殘留檢測的固

7、相萃取-高效液相色譜-熒光檢測法。動(dòng)物組織樣品用PBS溶液提取，HLB固相萃取柱凈化。以1.0～100 ng/g的濃度水平添加時(shí)，動(dòng)物肌肉組織中10種藥物的平均回收率范圍在72.8％～106.8％之間，日內(nèi)變異系數(shù)范圍在0.50％～7.4％之間，日間變異系數(shù)范圍在4.3％～10.3％之間。方法的檢測限均為0.3 ng/g，定量限為1.0 ng/g。 建立了動(dòng)物肌肉、肝臟組織中MAR、ENO、OFL、PEF、NOR、CIP、LOM

8、、DAN、ENR、 SAR、DIF、OXO、FLu等13種ONs多殘留檢測的免疫親和色譜-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。系統(tǒng)以0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸乙腈溶液-甲醇為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。動(dòng)物組織樣品提取后IAC柱凈化，甲醇-2％氨水(7:3，v/v)洗脫，0.1％甲酸水溶液復(fù)溶，LC-MS/MS測定。在0.3、1.0、10 ng/g的濃度添加水平，空白豬、雞肌肉組織13種藥物添加平均同收率范圍在68.3％～97.2％之間，日內(nèi)變異系數(shù)范

9、圍在6.6％～16.9％之間，日間變異系數(shù)范圍在8.8％～23.3％之間。雞、豬肝臟組織中13種藥物的平均同收率范同在62.3％～93.8％之間，日內(nèi)變異系數(shù)范圍在7.1％～19.3％之間，目間變異系數(shù)范同在12.7％～19.8％之間。方法的檢測限均為0.1 ng/g，定量限為0.3 ng/g。同時(shí)還研究建立了動(dòng)物肌肉中13種QNs多殘留檢測的同相萃取一液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。在0.5、1.0、10 ng/g的添加水平，上述13種藥物的平均