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文檔簡(jiǎn)介
1、喹諾酮類藥物(Qlinolones,QNs)是一類十分重要的人工合成的抗菌藥物,對(duì)革蘭氏陰性菌、大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、衣原體等具有殺滅作用,廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。然而細(xì)菌對(duì)該類藥物較易產(chǎn)生耐藥性,耐藥菌株可通過食物鏈向人類傳遞,此外動(dòng)物性食品中ONs殘留也可導(dǎo)致人體內(nèi)敏感細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,該現(xiàn)象已引起了全世界的關(guān)注。目前對(duì)動(dòng)物性食品中ONs殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)是確保食品安全和人類健康的最后一道防線。本研究建立了動(dòng)物組織中ONs免疫親和色譜柱凈化技術(shù),
2、并建立了可檢測(cè)ONs藥物多殘留的免疫親和-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法、固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法和免疫親和色譜-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法,為監(jiān)測(cè)動(dòng)物性食品中QNs藥物的殘留提供技術(shù)保障。 利用簇特異性的QNs單克隆抗體制備了可同時(shí)凈化麻保沙星(marbofloxacin,MAR)、依諾沙星(enoxacin,ENO)、氧氟沙星(ofloxacin,OFL)、培氟沙星(pefloxacin,PEF)、
3、諾氟沙星(norfloxacin,NOR)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、洛美沙星(lomefloxacin,LOM)、單諾沙星(danofloxacin,DAN)、恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)、沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)、二氟沙星(difloxacin,DIF)、惡喹酸(oxolinic acid,OXO)、氟甲喹(flumequine,F(xiàn)LU)等13種QNs的免疫親和色譜柱。本研究
4、制備的針對(duì)喹諾酮類的IAC柱,選用甲醇-PBS(7:3,v/v)作為洗脫溶液;以nmol/mL gel和nmol/mL IgG為單位表示IAC的動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量,更能體現(xiàn)IAC的特性。該IAC柱對(duì)每種ONs藥物的動(dòng)態(tài)柱容量為3.75~6.67 nmol/mL gel(1425~2135 ng/mL gel),絕對(duì)柱容量分別為0.75~1.33 nmol/mL IgG(285~427 ng/mg IgG)。在上述優(yōu)化的條件下,IAC
5、柱重復(fù)使用12次后,QNs的柱容量仍能達(dá)到初始柱容量的389/0~45%,滿足QNs殘留分析要求。IAC柱重復(fù)使用20次后,藥物的回收率與樣品的凈化效果無明顯變化。 建立了動(dòng)物肌肉、肝臟組織中10種QNs多殘留檢測(cè)的免疫親和-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法。動(dòng)物組織樣品用PBS溶液提取,提取溶液直接進(jìn)行IAC柱凈化,用PBS、水分別洗滌,用甲醇-PBS(7:3,v/v)洗脫。以0.5~100 ng/g的濃度水平添加時(shí),雞、豬肌肉組織中
6、10種QNs藥物的平均回收率范圍在81.7%~100.4%之間,日內(nèi)變異系數(shù)范圍在2.7%~12.5%之間,日間變異系數(shù)范圍在6.9%~14.3%之間。雞、豬肝臟組織中10種藥物的平均回收率范圍在74.7%~94.8%之間,日內(nèi)變異系數(shù)范圍在3.9%~12.1%之間,日間變異系數(shù)范圍在6.95%~16.8%之間。方法的檢測(cè)限均為0.15 ng/g,定量限為0.5 ng/g。 同時(shí)還建立了雞、豬肌肉組織中10種QNs多殘留檢測(cè)的固
7、相萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法。動(dòng)物組織樣品用PBS溶液提取,HLB固相萃取柱凈化。以1.0~100 ng/g的濃度水平添加時(shí),動(dòng)物肌肉組織中10種藥物的平均回收率范圍在72.8%~106.8%之間,日內(nèi)變異系數(shù)范圍在0.50%~7.4%之間,日間變異系數(shù)范圍在4.3%~10.3%之間。方法的檢測(cè)限均為0.3 ng/g,定量限為1.0 ng/g。 建立了動(dòng)物肌肉、肝臟組織中MAR、ENO、OFL、PEF、NOR、CIP、LOM
8、、DAN、ENR、 SAR、DIF、OXO、FLu等13種ONs多殘留檢測(cè)的免疫親和色譜-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。系統(tǒng)以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液-甲醇為流動(dòng)相,進(jìn)行梯度洗脫。動(dòng)物組織樣品提取后IAC柱凈化,甲醇-2%氨水(7:3,v/v)洗脫,0.1%甲酸水溶液復(fù)溶,LC-MS/MS測(cè)定。在0.3、1.0、10 ng/g的濃度添加水平,空白豬、雞肌肉組織13種藥物添加平均同收率范圍在68.3%~97.2%之間,日內(nèi)變異系數(shù)范
9、圍在6.6%~16.9%之間,日間變異系數(shù)范圍在8.8%~23.3%之間。雞、豬肝臟組織中13種藥物的平均同收率范同在62.3%~93.8%之間,日內(nèi)變異系數(shù)范圍在7.1%~19.3%之間,目間變異系數(shù)范同在12.7%~19.8%之間。方法的檢測(cè)限均為0.1 ng/g,定量限為0.3 ng/g。同時(shí)還研究建立了動(dòng)物肌肉中13種QNs多殘留檢測(cè)的同相萃取一液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。在0.5、1.0、10 ng/g的添加水平,上述13種藥物的平均
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