磺胺類及氟喹諾酮類藥物兔單克隆抗體的制備與多殘留檢測技術(shù)研究.pdf

1、磺胺和氟喹諾酮類藥物是感染性疾病的治療藥物，由于有促進動物生長、改善動物產(chǎn)品品質(zhì)、降低動物發(fā)病率及死亡率等作用，常被作為飼料添加劑用于飼料中。但長期不合理使用這些人畜共用或與醫(yī)用同源的藥物作為飼料添加劑，可使機體內(nèi)某些致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而降低了治療效果并殘留于動物性食品中，對人體健康造成危害，因此，開發(fā)快速、靈敏的檢測技術(shù)對于動物性食品的質(zhì)量控制，保障食品安全具有重要意義。
　　 本研究在總結(jié)前人工作經(jīng)驗的基礎(chǔ)上探討了將兔單克

2、隆抗體技術(shù)用于檢測磺胺和喹諾酮類多殘留的可能性，合成了磺胺和喹諾酮類藥物的人工抗原，通過抗原混和免疫，獲得了免疫脾臟，運用雜交瘤技術(shù)分別制備了抗磺胺和抗氟喹諾酮藥物殘留的新型兔單克隆抗體SAs-80-8、FQs-111-2及FQs-31-3。建立了ELISA檢測方法，構(gòu)建了檢測牛奶和豬尿樣品中磺胺藥物類殘留的免疫金標檢測方法，其主要研究結(jié)果如下：
　　 1、磺胺類免疫抗原通過SD、SMX分別與載體BSA重氮偶聯(lián)生成SD-BSA、

3、SMX-BSA，合成的SMX-BSA和SD-BSA同時作為免疫抗原，采用混和免疫的方法免疫四只新西蘭大白兔。合成磺胺母核結(jié)構(gòu)TS，將其與載體OVA偶聯(lián)合成包被抗原。通過血清篩選，選擇血清效價較高的11421號兔子，取其脾臟進行細胞融合。
　　 2、兔子脾細胞與骨髓瘤細胞240E融合培養(yǎng)，初篩共獲得122個陽性孔。復(fù)篩選擇了9株細胞克隆進入亞克隆階段。最終選擇了雜交瘤細胞株80-8進行抗磺胺類藥物單克隆抗體的生產(chǎn)。
　　

4、3、對抗體SAs-80-8的免疫學(xué)性質(zhì)研究證實該抗體與四種磺胺藥物有良好的競爭抑制作用，測得其對磺胺噻唑IC50值為0.68ng/mL，磺胺吡啶IC50值為1.15ng/mL，磺胺嘧啶IC50值為1.11ng/mL，磺胺甲惡唑IC50值為5.27ng/mL，對于四種磺胺藥物混和物的IC50值為3.31ng/mL。豬尿及牛奶三個濃度的混合加標實驗中，測得豬尿的回收率為92.6％-104.3%，牛奶的回收率為61.1%-81.6%，變異系數(shù)

5、小于20%。
　　 4、應(yīng)用兔單克隆抗體SAs-80-8，制備了四種磺胺類藥物(磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲惡唑)的膠體金免疫試紙條，用于快速靈敏的定量分析。該試紙條對磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲惡唑四種藥物的IC50值分別為5.19ng/mL、1.25ng/mL、0.66ng/mL與24.14ng/mL。加標牛奶中三個添加濃度回收率為78.02-135.10%，加標豬尿中三個添加濃度回收率為76.40-137.

6、16%。建立的免疫膠體金方法與LC-MS/MS分析結(jié)果一致，證明了該方法可用于實際樣品快速、準確的定量分析。
　　 5、選擇氧氟沙星、達氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氟甲喹六種氟喹諾酮類小分子與BSA合成偶聯(lián)物，通過混和免疫得到對多抗原的多抗血清，最終選擇了11413號兔子的脾細胞進行融合。
　　 6、兔子脾細胞與240E骨髓瘤細胞融合培養(yǎng)，初篩共獲得194個陽性孔。復(fù)篩選取5株多克隆進行亞克隆。最終選擇111-

7、2、31-3雜交瘤細胞株分別生產(chǎn)抗氟喹諾酮藥物和抗氧氟沙星藥物的單克隆抗體。
　　 7、抗體FQs-111-2對六種氟喹諾酮類藥物有良好的競爭抑制作用，對恩諾沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟羅沙星、達氟沙星六種藥物的IC50值都小于10 ng/mL，對諾氟沙星、沙拉沙星、依諾沙星三種藥物IC50值小于100ng/mL，對環(huán)丙沙星及洛美沙星兩種藥物IC50值小于200ng/mL。對于氟喹諾酮藥物混和物的IC50值為0.32n

8、g/mL的，最低檢測限IC10值為0.10ng/mL。通過豬尿及牛奶三個濃度混和加標實驗，測得豬尿的回收率53.44%-97.31%，變異系數(shù)3.32%-14.67%。牛奶的回收率93.07%-139.69%，變異系數(shù)2.32%-5.51%。
　　 抗體FQs-31-3對氧氟沙星有很好的競爭抑制作用，其IC50值為0.24ng/mL。對培氟沙星及氟羅沙星的IC50值分別為6.51ng/mL和0.99ng/mL。通過豬尿及牛奶中氧