Brevican在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生中的生物學(xué)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分Brevican在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)及其臨床意義
　　腦膠質(zhì)瘤是臨床上最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率占全部顱內(nèi)腫瘤的50％左右。在腦膠質(zhì)瘤的不同組織分型中，以星形膠質(zhì)細(xì)胞起源的腫瘤最為多見。根據(jù)WHO2000年腫瘤病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，所有星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤分為四級(jí)(Ⅰ級(jí)～Ⅳ級(jí))。膠質(zhì)瘤患者預(yù)后往往不良，特別是其膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ⅳ級(jí))患者的生存期往往不到一年。為進(jìn)一步改善腦膠質(zhì)瘤的治療效果，研究者一直致力于發(fā)現(xiàn)新的具有診斷和/或治療意

2、義的生物標(biāo)志分子，但是直至目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)一種理想的、能夠很好地滿足臨床需要的生物標(biāo)志物(Biomarker)。
　　短蛋白聚糖(Brevican)又稱為腦富含的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的硫酸軟骨素蛋白聚糖(Chondroitin SulfateProteoglycan，CSPG)。Brevican是lectican家族的新成員，由于其長(zhǎng)度最短故稱為短蛋白聚糖。目前已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道，Brevica

3、n的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)，而且與膠質(zhì)瘤的侵襲性密切相關(guān)。然而，Brevican在各級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)特點(diǎn)目前還不清楚;Brevican是否能夠成為新的、有價(jià)值的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤生物標(biāo)志分子尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　在本部分的研究中，我們通過分子克隆技術(shù)，獲得含Brevican片段的融合蛋白，用該融合蛋白免疫新西蘭兔，獲得抗血清，進(jìn)而純化出抗Brevican抗體。我們用此抗體系統(tǒng)地檢測(cè)了Brevican分子在腦膠質(zhì)瘤及良性

4、對(duì)照組（腦膜瘤和無激素垂體瘤）中的表達(dá)特征，揭示了Brevican表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤之間的關(guān)系，特別是與病理分級(jí)、分化和浸潤(rùn)程度的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，Brevican的表達(dá)主要定位于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿以及細(xì)胞外基質(zhì)中，彌漫表達(dá)，染色淡黃至棕黃，有的均質(zhì)狀，有的細(xì)顆粒狀。Brevican的表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)（均為P＞0.05）;在良性對(duì)照組中表達(dá)量很低，陽性率僅為22.5％(9/40);而在膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平則較高，陽性率可達(dá)68.3％(41

5、/60)，并且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度（從Ⅰ級(jí)的毛細(xì)胞型膠質(zhì)瘤至Ⅳ級(jí)的膠母型膠質(zhì)瘤）的提高，其陽性率逐級(jí)增高，且免疫組化的陽性積分也逐級(jí)升高。因而，Brevican可能是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的一個(gè)有價(jià)值的生物標(biāo)志，對(duì)病情的評(píng)估、預(yù)后的判斷有較高的價(jià)值。
　　第二部分 Brevican在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能研究
　　目前，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制均不清楚。膠質(zhì)瘤呈侵襲性生長(zhǎng)，這一重要特性為其本質(zhì)特征，明顯有別于其他惡性腫瘤，也是

6、膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率高、預(yù)后不良的重要原因。瘤體本身也就是浸潤(rùn)性生長(zhǎng)物，它和正常腦組織沒有明顯的界限，給手術(shù)治療帶來困難，對(duì)放、化療亦不甚敏感。我們的研究已表明，Brevican的表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展呈正相關(guān)關(guān)系，但Brevican在生長(zhǎng)、侵襲、進(jìn)展中具體作用及機(jī)制尚未明確。因此，本部分我們以調(diào)控Brevican基因表達(dá)為起始點(diǎn)，通過上調(diào)(overexpression)或者下調(diào)(knockdown) Brevican的表達(dá)水平，比較分析其對(duì)

7、膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響以及其在相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用及機(jī)制。
　　本研究我們建立了Brevican穩(wěn)定過表達(dá)的U251-Brevican（“TU251細(xì)胞”）和293T-Brevican細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不同的粘附介質(zhì)上，這兩株細(xì)胞的粘附能力較相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞明顯增強(qiáng)，特別是在纖維連接蛋白(FN)存在時(shí);而且，U251-Brevican細(xì)胞的遷移能力也明顯增強(qiáng)。另外，我們利用RNA干擾技術(shù)，通過構(gòu)建并轉(zhuǎn)染pSuper-Bre

8、vican shDNA，表達(dá)相應(yīng)的shRNA，從而下調(diào)Brevican在TU251細(xì)胞中的表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上，我們發(fā)現(xiàn)這類Brevican knockdown的細(xì)胞，CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)均表明其增殖能力下降;細(xì)胞免疫熒光顯示細(xì)胞之間的擴(kuò)散、伸展能力下降，進(jìn)一步通過劃痕實(shí)驗(yàn)(Wound-healing assay)也證實(shí)其遷移能力明顯較對(duì)照組降低;穿透Marigel的能力也變?nèi)?。更進(jìn)一步，對(duì)Brevican在人工構(gòu)建的膠質(zhì)瘤TU25

9、1細(xì)胞中的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，在Brevican表達(dá)抑制的TU251細(xì)胞被EGF激活后，Brevican表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞活化后絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，包括Erk1/2的磷酸化過程被部分抑制，即Brevican的表達(dá)下調(diào)降低了MAPK在TU251細(xì)胞活化過程中的活性。這提示Brevican在TU251細(xì)胞的活化過程中參與了對(duì)MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。同時(shí)，我們的實(shí)

10、驗(yàn)也揭示Brevican knockdown細(xì)胞中Akt的磷酸化水平也明顯低于對(duì)照的TU251-shDNA mock細(xì)胞，這說明Brevican也參與了Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤(rùn)。
　　我們的研究顯示，Brevican在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為包括維持細(xì)胞形態(tài)、粘附、遷移以及侵毒中發(fā)揮了極其重要的作用;本研究也首次揭示了Brevican在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活化過程中參與了對(duì)MAPK以及PI3

11、K/Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。近年來，神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞外基質(zhì)(NECM)日益引起重視，腦膠質(zhì)瘤的NECM的可溶性（液化程度）增加，這都可能與Brevican的上調(diào)程度有關(guān)。因而,特異性地阻斷膠質(zhì)瘤中Brevican的表達(dá)或酶裂解其蛋白，有可能為膠質(zhì)瘤的治療和預(yù)防復(fù)發(fā)提供新的途徑。
　　第三部分 Brevican在腫瘤形成中的作用及其機(jī)制研究
　　膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)外胚層的惡性腫瘤，一般不發(fā)生顱外轉(zhuǎn)移，較晚期才出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，導(dǎo)

12、致獲得診斷時(shí)腫瘤多已為晚期，故手術(shù)難以完全切除。
　　本部分研究主要是應(yīng)用我們建立的Brevican抑制表達(dá)細(xì)胞(TU251-pSuper-shDNA2細(xì)胞)和對(duì)照組（TU251-pSuper-shDNA mock、TU251未處理）細(xì)胞，裸鼠皮下接種，觀察、比較這兩組細(xì)胞在腫瘤形成中的差別，從而明確Brevican在轉(zhuǎn)化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在腫瘤形成中的作用。同時(shí)，更重要的是，我們也進(jìn)行了轉(zhuǎn)化膠質(zhì)瘤細(xì)胞的裸鼠顱內(nèi)接種，這樣可以在更接近于

13、腦膠質(zhì)瘤形成的微環(huán)境條件下，比較腦膠質(zhì)瘤成瘤過程;因而，更可靠地研究膠質(zhì)瘤顱內(nèi)生長(zhǎng)情況和檢驗(yàn)該腫瘤標(biāo)志Brevican確切的臨床價(jià)值。通過本部分實(shí)驗(yàn)，我們更深入地揭示Brevican基因在腦膠質(zhì)瘤形成和發(fā)展的作用;實(shí)驗(yàn)顯示，在將Brevican表達(dá)抑制的TU251細(xì)胞即TU251-pSuper-shDNA2細(xì)胞以及對(duì)照組（TU251-pSuper-shDNA mock細(xì)胞、TU251未處理細(xì)胞）皮下注射后4w(28d)時(shí)，Brevica

14、n表達(dá)抑制的TU251-pSuper-shDNA2細(xì)胞成瘤能力明顯低于對(duì)照組細(xì)胞(P＜0.05);同樣，在以上兩組細(xì)胞進(jìn)行顱內(nèi)接種25d后，也觀察到TU251-pSuper-shDNA2細(xì)胞的致瘤能力降低（P＜0.01）。
　　上述轉(zhuǎn)化膠質(zhì)瘤細(xì)胞的動(dòng)物體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)亦進(jìn)一步證實(shí)，Brevican在腦膠質(zhì)瘤形成中發(fā)揮了極其重要作用。Brevican水平降低與膠質(zhì)瘤的形成、擴(kuò)展能力下降密切相關(guān)，進(jìn)一步說明Brevican基因和/或編碼的