miR-489通過抑制SPIN1逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療耐藥的研究.pdf

1、背景:
　　乳腺癌已成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。包括手術(shù)切除、術(shù)后化療等在內(nèi)的綜合治療是提高乳腺癌患者生存率的最有效手段。目前乳腺癌新輔助化療已被廣泛應(yīng)用。然而腫瘤耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致乳腺癌患者化療失敗的主要因素。miRNAs是近期腫瘤研究的前沿熱點之一。研究表明，miRNAs能夠通過直接作用于靶mRNA而抑制信號傳導(dǎo)通路基因或藥物誘導(dǎo)的凋亡基因，從而導(dǎo)致耐藥。本研究檢測了乳腺癌耐藥組和敏感組人體標本中miR-489的表達，并通過

2、體內(nèi)外功能實驗和靶基因驗證，揭示了miR-489抑制乳腺癌耐藥性產(chǎn)生的機制。
　　方法:
　　收集乳腺癌穿刺病例組織標本及同病例化療后手術(shù)切除組織標本，并據(jù)化療敏感性分為耐藥組和敏感組。取化療前穿刺病例組織提取RNA、逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR檢測兩組各自miR-489表達;miR-489前體及miR-489抑制劑瞬時轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞，并進行MTS、EdU實驗以檢測miR-489對乳腺癌細胞增殖的影響、流式細胞學(xué)技術(shù)檢測miR

3、-489對細胞凋亡的影響、Transwell實驗檢測miR-489對細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響;建立過表達miR-489荷瘤小鼠模型，觀察miR-489對化療敏感性的影響;利用TargetScan，Pictar和Miranda三種軟件預(yù)測miR-489的靶基因，并進行熒光素酶報告基因、免疫組化和Westernblot驗證:免疫組化方法檢測耐藥組和敏感組乳腺癌標本中SPIN1的表達，分析SPIN1與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　結(jié)果:

4、
　　1.實時熒光定量PCR檢測:miR-489在耐藥組乳腺癌組織中的表達較敏感組組織明顯降低。miR-489在耐阿霉素乳腺癌細胞MCF-7/ADM較親本細胞MCF-7中的表達明顯下調(diào)。同時，在高侵襲力的乳腺癌細胞MDA-MB-231中，miR-489的表達相比于低侵襲力的乳腺癌細胞MCF-7、T47D顯著降低。
　　2.體外細胞功能學(xué)實驗:MTS、EdU、遷移與浸潤實驗結(jié)果顯示，乳腺癌細胞過表達miR-489后，其增殖、侵

5、襲和遷移能力與對照組相比，均明顯降低;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，過表達miR-489組較對照組具有更強的促凋亡作用。然而，miR-489抑制劑組較對照組增殖、侵襲和遷移能力均增強，凋亡能力減弱。綜上，我們的結(jié)果提示miR-489具有抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移，并促進其凋亡的作用。
　　3.荷瘤裸鼠實驗:過表達miR-489組的裸鼠較對照組對化療敏感，過表達miR-489組的瘤體生長速度、體積明顯小于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，并且

6、，過表達miR-489可抑制腫瘤向周圍肌層的浸潤。
　　4.預(yù)測并驗證靶基因:通過Pictar、TargetScan和Miranda軟件預(yù)測并結(jié)合相關(guān)文獻初步選定8個待驗證靶基因，分別進行雙熒光素酶實驗檢測，證實miR-489可與SPIN1的3'-UTR區(qū)結(jié)合。繼而，免疫組化與westernblot實驗再次驗證，結(jié)果顯示:過表達miR-489組與對照組相比，SPIN1蛋白表達顯著降低。這提示SPIN1是miR-489的直接靶基因。