MicroRNA-205通過調(diào)節(jié)AMOT的表達(dá)抑制乳腺癌的增殖與侵襲.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，主要發(fā)生于女性，偶見于男性。在歐美等發(fā)達(dá)國家乳腺癌的發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第一，在我國女性腫瘤發(fā)病率中亦高居榜首，并且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增。全國腫瘤登記中心公布的2016年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國的乳腺癌發(fā)病率近些年來明顯增高，每年新發(fā)病例為27.3萬，并且發(fā)病年齡越來越趨于年輕化。乳腺癌已經(jīng)成為威脅女性身心健康、危害女性生命的頭號殺手。近年來隨著乳腺癌早期診斷水平和健康普查的不斷提高，個體化治療設(shè)計已成為目前乳腺

2、癌主要的治療策略，合理地綜合應(yīng)用手術(shù)、放療、化療、生物靶向治療、內(nèi)分泌治療等多種治療手段，使得乳腺癌患者的總體生存率有了明顯提高。乳腺癌已經(jīng)成為預(yù)后較好的實體瘤之一。腫瘤是由多因素、多步驟、多基因、多信號途徑互相影響、互相作用的復(fù)雜生物學(xué)過程共同作用所形成的。乳腺癌的發(fā)病因素有多個，包括月經(jīng)初潮年齡和絕經(jīng)年齡、生育因素、哺乳情況、遺傳、生活方式、內(nèi)分泌狀況，情緒、電離輻射等均與乳腺癌的發(fā)病有關(guān)。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)等科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，

3、多學(xué)科交叉后引發(fā)了從分子、基因等角度去探討腫瘤的發(fā)生發(fā)展的熱潮。
　　microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的，短的非編碼RNAs，能夠通過與靶基因mRNA的3’-UTR的堿基互補(bǔ)配對來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，并導(dǎo)致靶mRNA的降解，或者直接介導(dǎo) mRNA的降解。除此之外，miRNA也能夠在堿基與靶基因不完全配對時抑制翻譯。miRNA對細(xì)胞的增殖、形態(tài)、凋亡和分化等方面扮演重要角色并且具有組織特異性的特點(diǎn)，另外它在腫瘤的演進(jìn)過程中也起

4、著重要作用。miRNA的異常表達(dá)通過調(diào)控靶基因的mRNA使其表達(dá)發(fā)生改變從而達(dá)到對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控。miRNA調(diào)控基因表達(dá)成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)?，F(xiàn)階段研究者從腫瘤的靶向治療和個體化治療出發(fā)，進(jìn)行多種嘗試，并且已經(jīng)取得一定成果。因此，尋找新的分子靶點(diǎn)對于乳腺癌患者的診斷和治療以及改善預(yù)后都具有十分重要的意義。miRNA-205被發(fā)現(xiàn)了很長時間，但它的生物功能才剛剛開始被研究。研究顯示miRNA-205的表達(dá)在許多腫瘤中是減少的，

5、miRNA-205起到腫瘤抑制作用并參與許多生理和病理過程。miRNA功能研究的核心是miRNA靶基因的研究，明確miRNA如何通過調(diào)控靶基因，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的哪些生命活動，以及怎樣影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。故而，miRNA研究工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)一直是發(fā)現(xiàn)并明確 miRNA調(diào)控的靶基因及所參與的信號通路。
　　腫瘤的生長過程離不開血管的生成，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移階段也離不開腫瘤血管的生成，可見血管生成對腫瘤的生物學(xué)行為至關(guān)重要。Angiom

6、otin(AMOT)是一種由675個殘基組成的蛋白質(zhì)，又稱血管生成抑制素結(jié)合蛋白，顧名思義，是由一種膜相關(guān)蛋白與血管生成抑制素結(jié)合而形成。能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)遷移以及內(nèi)皮細(xì)胞趨向生長因子的遷移。有研究顯示AMOT的表達(dá)量在發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中遠(yuǎn)高于未轉(zhuǎn)移者。然而目前尚不明確AMOT的上調(diào)機(jī)制。
　　miRNA-205在乳腺癌中的表達(dá)是顯著下降的，有研究顯示在乳腺癌中AMOT的表達(dá)是顯著增高的，在表達(dá)量上兩者之間呈負(fù)相關(guān)，所以我們

7、選擇miRNA-205來分析AMOT在乳腺癌中的角色。我們推測miRNA-205對AMOT的表達(dá)有調(diào)控作用。但目前尚無關(guān)于miRNA-205對AMOT的調(diào)控作用的報道，以及在人乳腺癌細(xì)胞中miRNA-205對AMOT作用機(jī)制的研究。本研究分三部分內(nèi)容分別闡述miRNA-205與AMOT在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能作用以及其分子調(diào)控機(jī)制，為乳腺癌的診斷和治療帶來新的思路并且增強(qiáng)了我們對于AMOT轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的認(rèn)識。
　　第一部分 miRN

8、A-205、AMOT在乳腺癌組織中的表達(dá)
　　方法：
　?。?）采用qRT-PCR技術(shù)檢測20例乳腺癌組織標(biāo)本和20例正常鄰近組織標(biāo)本中的miRNA-205的mRNA表達(dá)水平。
　?。?）Real time PCR檢測AMOT在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的mRNA表達(dá)變化；Western Blot檢測AMOT在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的蛋白表達(dá)變化。
　?。?）Real time PCR實驗檢測SKBR-3、M

9、DA-MB-435S、MCF-7中miRNA-205的表達(dá)。
　?。?）統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有實驗重復(fù)3次，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；計量資料采用x?s方式表達(dá)。組間比較采用單因素方差分析t-檢驗，P﹤0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?。?） miRNA-205在乳腺癌組織中的表達(dá)量及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，乳腺癌組織的表達(dá)(0.130±0.003)明顯低于癌旁正常組織(

10、1.004±0.048)，（P﹤0.05）差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　（2）Real time PCR法檢測AMOT在腫瘤組織中的表達(dá)（4.027±0.158）與匹配的正常組織（1.228±0.050）相比顯著上調(diào)，（P＜0.0001）差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western Blot在蛋白水平的表達(dá)說明AMOT在乳腺癌組織中高表達(dá)。
　　（3）Real time PCR檢測miRNA-205在不同的乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平。以SKBR

11、-3細(xì)胞株的miRNA-205的表達(dá)量為1，MDA-MB-435S的表達(dá)量為2.49±0.21，MCF-7的表達(dá)量為0.25±0.01，（P﹤0.05）差異有統(tǒng)計學(xué)意義。MCF-7的表達(dá)量為最低，通過篩選，成為后續(xù)實驗細(xì)胞株。
　　第二部分miRNA-205對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響
　　方法：
　　（1）采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics至乳腺癌細(xì)胞72

12、h后，用RT-PCR法測定miRNA-205的表達(dá)情況。
　?。?）CCK8實驗檢測轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics后乳腺癌細(xì)胞MCF-70,12,24,48,96h生長曲線。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics后乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞凋亡情況。
　?。?）Transwell檢測轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics后乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞遷移實驗。
　　(5)轉(zhuǎn)染miRNA-20

13、5 mimics以后分別以RT-PCR法和Western Blot檢測AMOT的表達(dá)水平，明確miRNA-205過表達(dá)對AMOT的表達(dá)的影響。
　　(6)所有數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism6統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，每組實驗進(jìn)行3次，通過未配對獨(dú)立樣本t-檢驗或者單因素方差分析ANOVA，計數(shù)資料以x?s方式表達(dá)。P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?。?）為了明確轉(zhuǎn)染miRNA-205mimics后miRNA-

14、205的表達(dá)變化情況，我們在轉(zhuǎn)染后72h對miRNA-205進(jìn)行了RT-PCR檢測，以NC（陰性對照 RNA）為對照組，以 U6為內(nèi)參。結(jié)果顯示，miRNA-205的轉(zhuǎn)染可顯著上調(diào)miRNA-205的表達(dá)量（轉(zhuǎn)染后的相對表達(dá)量是NC組的82倍）。P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?。?）我們通過CCK-8法對miRNA-205mimics處理前后的乳腺癌細(xì)胞生長情況進(jìn)行了檢測。實驗結(jié)果顯示，隨著觀察時間的延長0,12,24,48,9

15、6h，mimics處理后的細(xì)胞生長明顯下降，存在時間依賴效應(yīng)。
　?。?）用miRNA-205 mimic/NC處理后培養(yǎng)24小時，用Annexin V-FITC和PI染色后運(yùn)用流式細(xì)胞檢測術(shù)，進(jìn)一步明確 miRNA-205對MCF-7細(xì)胞株的凋亡無影響，P﹥0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　?。?） Transwell實驗來檢測腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力。細(xì)胞分組：mimic組和NC，用Transwell小室實驗分別觀察細(xì)胞遷移能力，實

16、驗結(jié)果顯示miRNA-205過表達(dá)能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。mimic組為（175.1±9.16），NC組為（238.5±11.20），P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?。?）當(dāng)miRNA-205通過mimic過表達(dá)后，AMOT在mRNA水平的表達(dá)沒有受到明顯影響，P﹥0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。但在蛋白水平的表達(dá)較NC變?yōu)楸磉_(dá)下降，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　第三部分 miRNA-205的靶基因及影響乳腺癌的分子機(jī)

17、制探討
　　方法：
　?。?）為了確定miRNA-205在乳腺癌中能夠調(diào)節(jié)AMOT表達(dá)，我們應(yīng)用預(yù)測軟件TargetScan(www.targetscan.org)和miRDB(http://mirdb. org/miRDB)和MICRORNA(www.microrna.org)對miRNA-205靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了分析。
　?。?）構(gòu)建質(zhì)粒并驗證，并將AMOT的3’UTR進(jìn)行基因突變，實驗分組NC+AMOT-3’

18、UTR-WT；miR-205 mimics+ AMOT-3’UTR-WT；NC+AMOT-3’UTR-MUT；miR-205 mimics+AMOT-3’UTR-MUT，以雙熒光素酶實驗驗證AMOT是否是miRNA-205的靶基因。
　?。?）采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將siRNA或NC轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞，敲除AMOT后檢測乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力以及對凋亡的影響。
　?。?）采用脂質(zhì)體 L

19、ipofectamine2000轉(zhuǎn)染 AMOT過表達(dá)質(zhì)粒然后以Western Blot法檢測AMOT的表達(dá)，實驗分組為miRNA-205+AMOT-3'UTR-WT，miRNA-205+Vector（空質(zhì)粒）。
　?。?）共轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics和AMOT過表達(dá)質(zhì)粒與共轉(zhuǎn)染miRNA-205和空質(zhì)粒后進(jìn)行CCK-8實驗檢測MCF-7的增殖、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移能力，進(jìn)一步檢測A

20、MOT過表達(dá)后對MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為的影響并了解對miRNA-205過表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)分析，根據(jù)互補(bǔ)配對原則，我們發(fā)現(xiàn)，AMOT基因3’-UTR在2938-2945有一個序列片段可能與 miRNA-205結(jié)合。
　?。?）通過PCR產(chǎn)物電泳、雙酶切電泳及質(zhì)粒測序鑒定并Blast比對，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功，雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證 AMOT是 miRNA-205的靶基因，各組熒光素酶相

21、對活性值分別為：NC+AMOT-3’UTR-WT(4.79±0.24)；miR-205mimics+AMOT-3’UTR-WT(2.34±0.23)；NC+AMOT-3’UTR-MUT(4.8±0.16)；miR-205 mimics+AMOT-3’UTR-MUT(4.52±0.25)，結(jié)果說明miRNA-205與AMOT-3’UTR-WT的作用位點(diǎn)能夠結(jié)合（P＜0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?。?）siRNA干擾AMOT后Wes

22、tern blot檢測發(fā)現(xiàn)AMOT的蛋白表達(dá)顯著下降。通過CCK-8法對轉(zhuǎn)染siRNA處理前后的乳腺癌細(xì)胞生長情況進(jìn)行了檢測。實驗結(jié)果顯示，隨著觀察時間的延長0,12,24,48,96h，siRNA處理后的細(xì)胞生長明顯下降，存在時間依賴效應(yīng)。流式細(xì)胞檢測術(shù)siRNA干擾AMOT后同miRNA-205過表達(dá)一樣對凋亡沒有影響。Transwell檢測乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果提示：MCF-7細(xì)胞的遷移能力顯著下降，NC組為

23、（238.5±11.20）；AMOT-siRNA組為（124.4±10.4），P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?。?） AMOT過表達(dá)實驗進(jìn)一步證實AMOT是miRNA-205的靶基因，共轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics和AMOT過表達(dá)質(zhì)粒或空質(zhì)粒后以Western Blot檢測AMOT在蛋白水平的表達(dá)，提示較對照組（空質(zhì)粒）的AMOT表達(dá)水平顯著提高，提示 AMOT過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miRNA-205 mimics對AMOT表達(dá)

24、抑制。
　?。?）共轉(zhuǎn)染miRNA-205 mimics和AMOT過表達(dá)質(zhì)粒后可以部分逆轉(zhuǎn)miRNA-205對乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7細(xì)胞的增殖和遷移的抑制作用。結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞株的生長抑制解除，且遠(yuǎn)超過對照組的細(xì)胞增殖，隨著時間的延長而顯著，在72h時這種解除效應(yīng)達(dá)到最大，在72-96h之間處于平臺期。細(xì)胞凋亡情況再次用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示無明顯差異，P＞0.05。Transwell實驗檢測細(xì)胞的遷移能力，空質(zhì)粒組為（

25、136.1±13.8），AMOT過表達(dá)質(zhì)粒組為（219.1±11.48）。差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。共轉(zhuǎn)染AMOT過表達(dá)質(zhì)粒后，解除了miRNA-205過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞遷移的抑制。
　　結(jié)論：
　　1、miRNA-205在乳腺癌中的表達(dá)下調(diào)，AMOT在乳腺癌中的表達(dá)是顯著增高的，二者的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。
　　2、miRNA-205過表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，但對凋亡無明顯影響；miRN