miR-497通過靶向Smad7基因?qū)θ橄侔┑淖饔醚芯?pdf

1、目的：
　　乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的主要惡性腫瘤之一，同時(shí)也是世界女性發(fā)病率最高的癌癥。全世界每年約有120萬女性患乳腺癌，50萬死于乳腺癌。在西歐、北美等發(fā)達(dá)國(guó)家，乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤首位。而我國(guó)是乳腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)最快的國(guó)家之一，我國(guó)近年來乳癌發(fā)病率正以每年3％的速度遞增，成為城市中死亡率增長(zhǎng)最快的癌癥，發(fā)病年齡也呈逐漸年輕化的趨勢(shì)。在上海等大中城市中，乳腺癌患病率已連續(xù)20年位居女性惡性腫瘤第一位，嚴(yán)重危害廣大女性的健

2、康。微小RNA（microRNA，miRNA)是一類進(jìn)化上保守的非編碼小分子RNA，具有在翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)的功能。這些miRNAs可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，組織分化，因而與生命過程中發(fā)育、疾病有關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達(dá)與多種腫瘤相關(guān)，在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用，這些miRNAs的作用類似于抑癌基因和癌基因。不同腫瘤中miRNA有不同的表達(dá)譜。一種miRNA可以靶向多種靶基因從而發(fā)揮作用，而一個(gè)靶基因可以同時(shí)被多種miRNA

3、靶向。最新研究表明，Smad7在乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本研究中，我們通過targetscan，miRanda等軟件分析發(fā)現(xiàn)Smad7可能為miR-497的靶基因，運(yùn)用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、RT-PCR和Western Blot研究方法證實(shí)miR-497通過靶向Smad7來發(fā)揮作用，同時(shí)在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞系中驗(yàn)證高表達(dá)miR-497對(duì)細(xì)胞功能的影響，為乳腺癌的個(gè)體化治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　

4、我們根據(jù)websites targetscan，miRanda，miRGen and miRBase等軟件發(fā)現(xiàn)，Smad7為miR-497可能的靶基因。為了驗(yàn)證miR-497是否可以靶向Smad7的3'-UTR區(qū)從而發(fā)揮生物學(xué)作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，同時(shí)運(yùn)用RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)來證實(shí)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。MTT實(shí)驗(yàn)，平板克隆實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)來研究miR-497在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系和MCF-7

5、乳腺癌細(xì)胞系中的作用。
　　結(jié)果：
　　1、本研究中，運(yùn)用websites targetscan，miRanda，miRGen and miRBase等軟件發(fā)現(xiàn)，miR-497的堿基序列與Smad7 mRNA3'-UTR區(qū)存在互補(bǔ)關(guān)系，Smad7為miR-497的靶點(diǎn)之一。
　　2、通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中，實(shí)驗(yàn)組（共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics與Smad73'-UTR）與對(duì)照組

6、（共轉(zhuǎn)染miR-497 control與Smad73'-UTR）相比，熒光值明顯下降（P＜0.05）。共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics與Smad73'-UTR-mut后，熒光值上升（P＜0.05）。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中，實(shí)驗(yàn)組（共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics與Smad73'-UTR）與對(duì)照組（共轉(zhuǎn)染miR-497 control與Smad73'-UTR）相比，熒光值明顯下降（P＜0.05）。共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics

7、與Smad73'-UTR-mut后，熒光值上升（P＜0.05）。
　　3、在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中，分別過表達(dá)miR-497后，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)和Western Blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)Smad7 mRNA表達(dá)量與Smad7蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在miR-497過表達(dá)組Smad7 mRNA與Smad7蛋白的表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4、在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)

8、胞系和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中，分別按照0、25、50、75、100nmol/l濃度轉(zhuǎn)染miR-497，培養(yǎng)24h、48h、72h后，加入MTT在490nm下測(cè)得相應(yīng)OD值繪制曲線后分析，隨著時(shí)間和濃度的增加，抑制率隨之增加，表現(xiàn)出時(shí)間和濃度的依賴性，表明，miR-497有抑制細(xì)胞增殖的作用。
　　5、在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中，分別轉(zhuǎn)染miR-497 mimics(100nM)與miR-497

9、control，培養(yǎng)48h后，平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與miR-497 control組相比，miR-497 mimics組克隆形成率明顯下降，表明，miR-497有抑制細(xì)胞增殖的作用。
　　6、在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中，分別轉(zhuǎn)染miR-497 mimics(100nM)與miR-497 control，培養(yǎng)48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。與miR-497 control組相比，miR-497