基于家系WES-WGS檢測denovo突變并預(yù)測致病基因的DNRIA開發(fā)及應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　近年來，許多研究表明de novo突變在散發(fā)性疾病中起著重要的作用。隨著檢測技術(shù)的不斷提高，一些散發(fā)性疾病已經(jīng)被證實與擁有de novo突變的基因有關(guān)如Schinzel-Giedion syndrome, Kabuki syndrome, Bohring-Opitz syndrome, ASD和ALS。隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，無偏倚的WES及WGS已經(jīng)成為目前全面檢測de novo突變最有效的技術(shù)手段。因此，基于

2、高通量測序檢測de novo突變?nèi)找娉蔀樯l(fā)性疾病研究領(lǐng)域的熱點之一。
　　由于測序低質(zhì)量和短序列比對錯誤，僅僅基于過濾的方法從比對結(jié)果中直接找de novo突變會產(chǎn)生很多假陽性的位點。另外，de novo突變是生物進(jìn)化的原材料，正常人在自然狀態(tài)下也會產(chǎn)生一定數(shù)量的de novo突變。研究表明正常人與散發(fā)性病人中每一代每一個堿基的de novo突變速率基本在1×10-8左右，每個基因組平均約發(fā)生50-100次de novo突變事件

3、。由此可知，在病人中檢測到的denovo突變并非都是致病的，如何應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)的模型準(zhǔn)確、快速地找到與疾病相關(guān)的de novo突變是目前所要解決的重要問題。
　　基于以上迫切需求，本課題決定開發(fā)一套基于核心家系的新一代高通量DNA測序數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確快速地確定de novo及稀有遺傳突變的方法和工具。同時，該工具還能基于檢測到的de novo突變結(jié)合該突變所在基因的突變速率及相關(guān)聯(lián)的稀有遺傳突變信息給出每個de novo突變所在基因為潛在致

4、病基因的概率。
　　研究目的：
　　1、建立一個基于核心家系高通量測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確檢測de novo和稀有遺傳突變并預(yù)測致病基因的在線分析平臺DNRIA，為相關(guān)散發(fā)性疾病研究者提供一個方便的分析平臺以及工具上的支撐。
　　2、用開發(fā)好的DNRIA分析平臺對10 ASD家系的WES數(shù)據(jù)分析，期望找到與ASD發(fā)病相關(guān)的致病基因，并以此為例證明DNRIA的實用性。
　　方法：
　　1、采用Javascript，PHP

5、和Perl等腳本開發(fā)在線分析軟件DNRIA。
　　2、采用過濾結(jié)合EM模型的方法預(yù)測de novo突變位點。
　　3、預(yù)測的de novo和稀有遺傳突變經(jīng)ANNOVAR注釋后選取功能缺失和預(yù)測為有害的錯義突變位點。TADA基于以上信息進(jìn)行致病基因的預(yù)測。
　　4、提取收集的10個ASD家系的血液樣品DNA用于外顯子組測序;
　　5、測序得到的原始數(shù)據(jù)去低質(zhì)量堿基和接頭后與參考基因組比對，去PCR重復(fù)序列后得到的唯

6、一比對的序列用于GATK檢測突變。
　　6、使用本課題開發(fā)的DNRIA軟件對GATK的結(jié)果進(jìn)行de novo和稀有遺傳突變及致病基因的預(yù)測。
　　結(jié)果：
　　1、基于核心家系高通量測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確檢測de novo及稀有遺傳突變并進(jìn)行致病預(yù)測的在線分析軟件DNRIA已經(jīng)構(gòu)建完成。網(wǎng)址:http://122.228.158.106/DNRIA/index.php
　　2、對于構(gòu)建好的DNRIA軟件，采用了我們以前項目中

7、測序的32ASD家系的全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行軟件性能的評價。32ASD家系的項目中我們用DDR及ForestDNM的方法找到的85個位于編碼區(qū)、UTR區(qū)和重要非編碼RNA的de novo突變，經(jīng)Sanger驗證，其中54個突變正確31個突變錯誤。DNRIA軟件總共找到了56個突變位點其中52個是陽性結(jié)果，4個陰性結(jié)果，驗證率為92.9％、靈敏度為96.3％、特異性為87.1％。32ASD家系的數(shù)據(jù)經(jīng)DNRIA預(yù)測找到的稀有遺傳的突變位點有23

8、51個，包括Homozygous、Compoundheterozygous和Heterozygous。經(jīng)詳細(xì)注釋后，其中186個注釋為有害或功能缺失的突變位點，經(jīng)Sanger驗證182正確，驗證率為97.8％。
　　3、采用本研究開發(fā)的DNRIA軟件對新測序的10個ASD家系的全外顯子組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析找到并驗證成功了14個位于編碼區(qū)域的de novo突變，包括1個無義突變，6個非同義突變，7個同義突變以;6個位于編碼區(qū)域的功能缺失或

9、預(yù)測為有害的Recurrent heterozygous和Compound heterozygous突變位點;基于以上信息還預(yù)測出四個可能與ASD發(fā)病相關(guān)的基因PAK2(P=9.88E-05)，SLC6A5(P=0.002441),DNAH3(P=0.000384),ANK2(P=0.002495)。
　　結(jié)論：
　　DNRIA是一款能準(zhǔn)確快速檢測來源于核心家系高通量測序產(chǎn)生的denovo及稀有遺傳突變并預(yù)測致病基因的在線分