PPARγ激動劑羅格列酮對體外脂多糖刺激的枯否細胞中ⅠκB激酶β表達影響的研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是以肝細胞脂肪變性、小葉內炎癥伴灶性壞死為特征的一類遺傳-環(huán)境-代謝應激相關性臨床病理綜合征，常合并肥胖、糖尿病和高脂血癥，約30％NASH患者可進展為肝纖維化，甚至肝硬化，而成為隱源性肝硬化的重要原因之一。目前，NASH確切發(fā)病機制尚未完全闡明，最為成熟的“二次打擊”學說認為，胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、內毒素血

2、癥、氧化應激、脂質過氧化及炎癥細胞因子活化等多種因素互相關聯(lián)，共同參與NASH的病理生理環(huán)節(jié)。 枯否細胞(kupffer cells，KCs)雖為肝內固定的巨噬細胞，但承擔著全身單核巨噬細胞系統(tǒng)80％-90％的功能，其活化在內毒素(endotoxin，ET)介導的肝臟炎癥及免疫損傷中發(fā)揮至關重要的作用。眾所周知，核因子-кB(nuclearfactor-кB，NF-кB)是體內廣泛存在的對氧化應激敏感的一種前炎癥介質基因核轉錄調

3、控因子，通常情況下，大多數(shù)NF-кB與其抑制蛋白(NF-кB inhibitor，IкB)結合成無活性的二聚體，存在于胞漿中，僅少數(shù)處于活化狀態(tài)，參與維持細胞生長、抗凋亡等生理功能。在病理狀態(tài)下，內毒素的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可通過活化IкB激酶β(inhibit kappa B kinase β，IKKβ)，磷酸化降解IкB，引起IкB/NF-кB二聚體解離，導致NF-кB大量活化并迅速移位

4、核內，與DNA上特異性靶基因序列結合，啟動、調控眾多細胞因子、粘附分子和炎癥相關的酶及蛋白質的表達，誘導NASH的發(fā)生發(fā)展。羅格列酮(rosiglitazone，Ros．)為噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，其通過激活靶組織中特異性受體，即過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)調節(jié)糖、脂代謝，改善胰島素抵抗；此外亦有研究表明，PPARγ在KC中也廣泛表達

5、，羅格列酮通過抑制NF-кB的活性，參與調控肝組織炎癥反應，但其是否通過IKKβ信號通路發(fā)揮作用目前尚未明確，對于肝臟PPARγ與IKKβ之間相互關系的研究亦罕見報道。本研究旨在通過肝臟炎癥調控細胞-枯否細胞的體外分離培養(yǎng)，LPS刺激模擬肝臟炎癥反應，并應用PPARγ特異性激動劑羅格列酮干預，觀察細胞中IKKβ mRNA表達變化，以探討NASH損傷的分子機制，明確PPARγ激動劑羅格列酮抑制NF-кB活化的信號通路，為今后NASH的有效

6、防治提供新的思路。 方法：健康雄性Wistar大鼠12只，體重140±10g，標準飼料喂養(yǎng)一周后，采用原位肝門靜脈插管，Ⅳ型膠原酶消化、密度梯度離心以及差速貼壁分離等方法分離、純化大鼠肝臟正常KC，細胞得率約為(0.5-1.0)×10<'7>/鼠肝，0.4％臺盼蘭染色鑒定細胞存活率>95％，以2×10<'6>濃度接種于6孔板，并以含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng)。其中一孔置于熒光顯微

7、鏡下觀察，328nm處無自發(fā)熒光，然后向該孔加入20μl India ink(以1％明膠稀釋20倍)，培養(yǎng)4h后以含10％胎牛血清RPMI 1640沖洗，倒置相差顯微鏡下觀察細胞漿內吞噬顆粒，鑒定KC純度及其吞噬活性>90％。余培養(yǎng)孔細胞繼續(xù)標準培養(yǎng)24h后隨機分為四組(每組12復孔)： a組：正常對照組b組：LPS 1μg/ml組c組：LPS 1μg/ml+Ros．10μmol/L組d組：LPS 1μg/ml+Ros．50μmol/L

8、組標準培養(yǎng)24h后換液，分別加入含相應濃度LPS及羅格列酮的10％胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)干預培養(yǎng)48h，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及吞噬活性變化，收集培養(yǎng)細胞上清液(kupffer cell-conditioned mediumKCCM)，-80℃冰箱保存，酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)法檢測TNFα水平；Trizol試劑盒一步法提取KC中總RNA，逆轉錄聚

9、合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測KC中IKKβ mRNA表達。 結果： 1．置相差顯微鏡下KC形態(tài)變化：正常KC培養(yǎng)30min后即開始貼壁，12h伸出偽足，24h后形態(tài)舒展完全，呈星形或多角形。與正常KC相比，LPS刺激可促進細胞體積增大，早期出現(xiàn)形態(tài)改變且細胞形態(tài)舒展明顯，細胞核增大、胞漿疏松；功能測定發(fā)現(xiàn)，KC吞噬墨汁及分泌

10、TNFα能力均增強。應用羅格列酮可顯著抑制LPS的誘導作用，延緩細胞形態(tài)改變，延長細胞生存期，且作用強度與羅格列酮濃度呈正相關。 2．KC培養(yǎng)上清液中TNFα含量改變：與正常對照組(1.310±0.038)比較，LPS 1μg/ml組中TNFα含量顯著增高(1.856±0.049 P<0.01)；應用羅格列酮干預后TNFα水平升高幅度明顯降低，與LPS 1μg/ml組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(1.791±0.046，1.754±

11、0.056 P<0.01)，且兩實驗組間比較亦存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 3.IKKβ mRNA在KC中的表達：正常對照組KC中IKKβ mRNA表達量很低(0.224±0.014)，LPS刺激后表達量明顯增強(0.753±0.019 P<0.01)，應用羅格列酮干預培養(yǎng)可明顯抑制IKKβ mRNA表達升高(0.515±0.023，0.410±0.021 P<0.01)，且兩實驗組間統(tǒng)計學差異顯著(P<0.01)。相關分析表明，各

12、組KC中IKKβ mRNA表達與細胞培養(yǎng)上清液中TNF α含量均呈正相關(r值分別=0.676，0.809，0.753，0.626 P<0.05或<0.01)。 結論： 1.應用Ⅳ型膠原酶消化、密度梯度離心和差速貼壁分離的方法可以成功分離純化大鼠肝臟枯否細胞，為體外模擬肝臟炎癥反應提供基礎。 2.LPS刺激活化的KC中IKKβ mRNA表達增加，進而通過IKB/NF-кB/TNFα信號通路誘導組織炎癥介質合成釋放