印度酸橘CrNCED1啟動(dòng)子克隆及脅迫響應(yīng)分析.pdf

1、植物在生長過程要經(jīng)歷各種逆境，當(dāng)植物受到鹽害、低溫、干旱等環(huán)境脅迫時(shí)，植物細(xì)胞自身會迅速積累ABA響應(yīng)逆境，因此ABA是一種非常重要的逆境激素。NCED是ABA合成中的限速酶。本實(shí)驗(yàn)室克隆的印度酸橘基因CrNCED1受脅迫誘導(dǎo)，具有抗逆功能，但其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制并不清楚，因此分析CrNCED1基因啟動(dòng)子特有元件，研究其表達(dá)調(diào)控對闡明CrNCED1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及分離脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子有至關(guān)重要的意義。
　　 1.根據(jù)甜橙數(shù)據(jù)庫，利用同源序列

2、法克隆出CrNCED1基因1989 bp啟動(dòng)子序列。PLACE數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，此段序列區(qū)域除了含有TATA盒和CAAT盒等基本元件外，還含有ABRE、MYBCORE、BIHD10S、ERELEE4、GT1GMCAM4S等與逆境密切相關(guān)的元件。它們集中分布在ATG上游的1000 bp左右。
　　 2.設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了1058 bp的啟動(dòng)子片段，將其連接到酶切掉CaMV35S啟動(dòng)子的pCAMBIA1391雙元表達(dá)載體上，農(nóng)桿菌介導(dǎo)

3、法轉(zhuǎn)化煙草，通過潮霉素篩選，，獲得了煙草轉(zhuǎn)基因植株。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單純的DNA提取，PCR鑒定并不能獲得具有GUS活性的陽性植株，但是將DNA鑒定出來的植株進(jìn)一步提取RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行鑒定，獲得的植株一定是陽性株，通過此方法獲得轉(zhuǎn)基因株系#7和#8系。
　　 3.進(jìn)行組織特異性分析，選取轉(zhuǎn)基因株系（#7、#8）進(jìn)行GUS染色。結(jié)果表明，種子和果莢，沒有GUS基因表達(dá)，在葉片和果蒂中有較高的GUS表達(dá)。利用震動(dòng)切片和微分