小分子水凝膠承載Ad-HGF修飾的MSCs移植治療心肌梗塞及其機制探討.pdf

1、心肌梗死(MI)是心臟冠狀動脈供血不足造成的部分心肌因嚴(yán)重持久性缺血而發(fā)生的壞死,是引起死亡和心力衰竭的重要原因。近年來,干細胞的研究進展為該病的治療帶來了希望。骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有自我更新,取材方便,可從自體獲得,并且具有多向分化潛能和獨特的低免疫原性,成為目前組織工程理想的種子細胞。動物實驗和臨床研究均證實MSCs移植治療心肌梗死具有安全性和有效性。然而,由于MSCs中含有多種不同分化潛能的干細胞,單純MSCs移植后向心

2、肌分化率較低,且由于心肌梗死后局部缺血、缺氧和產(chǎn)生氧化應(yīng)激,致使MSCs存活能力低下,嚴(yán)重地影響了移植的效果[1-3]。因此,促進移植干細胞的存活和分化是決定移植成功與否的關(guān)鍵。
　　近年來,通過可注射性的支架材料攜帶干細胞移植修復(fù)壞死心肌已成為一種極有潛力的MI治療方法,可明顯提高移植細胞轉(zhuǎn)化效率、改善移植細胞體內(nèi)生存環(huán)境、進一步提高移植細胞的存活。小分子水凝膠是一類極具應(yīng)用前景的可注射性支架材料,在干細胞移植治療中的作用越來越

3、受到關(guān)注。本研究擬通過利用小分子水凝膠攜帶經(jīng)Ad-HGF(攜帶HGF基因的重組腺病毒)修飾后的MSCs進行心梗修復(fù)治療,并對其機制進行初步探討。本研究主要包含以下五部分內(nèi)容:
　　第一部分小分子水凝膠的設(shè)計、合成、表征、生物相容性及穩(wěn)定性測試
　　利用pi-pi離子鍵和氫鍵等非共價鍵的相互作用,設(shè)計出成膠的前體分子DFEFKDFEFKYRGD;使用多肽固相合成方法合成前體分子;通過流變儀獲得水凝膠的力學(xué)性能;SEM和共聚焦顯

4、微鏡觀察水凝膠的內(nèi)部形貌;使用圓二色譜和傅里葉紅外進行構(gòu)型表征;通過液質(zhì)聯(lián)用分析獲得水凝膠的生物穩(wěn)定性數(shù)據(jù);用水凝膠三維培養(yǎng)不同的細胞系,通過AO/EB染色及CCK-8法等獲得其生物相容性數(shù)據(jù);通過心肌及皮下注射獲得體內(nèi)相容性及降解數(shù)據(jù)。結(jié)果表明:制備的水凝膠適宜細胞的生長和增殖;具有可注射性;1％的水凝膠心肌注射,3天內(nèi)觀察SHMs沒有引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。結(jié)論:制備的水凝膠具有良好的細胞相容性、組織相容性及可生物降解性,可以滿足心肌組

5、織工程對可注射性支架材料的要求。
　　第二部分慢病毒介導(dǎo)的表達熒光素酶基因的MSCs細胞系及動物模型的建立
　　采用慢病毒感染的方法及報告基因構(gòu)建表達熒光素酶基因2(luciferase2+)的慢病毒表達載體,建立穩(wěn)定表達熒光素酶基因的MSCs-luc2+細胞系,采用MTT法對其生長特性進行鑒定,采用活體成像系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測MSCs-luc2+細胞在心梗大鼠體內(nèi)的滯留及存活情況。結(jié)果:通過慢病毒感染的方法及報告基因構(gòu)建對細胞系的

6、生長特性沒有產(chǎn)生影響,在相應(yīng)的心梗模型上驗證了熒光信號強度與移植細胞的在體內(nèi)滯留及存活的數(shù)量一致。結(jié)論:建立了攜帶穩(wěn)定表達熒光素酶基因的MSCs細胞系,掌握了利用熒光素酶對MSCs標(biāo)記進行心梗移植示蹤的關(guān)鍵技術(shù)。
　　第三部分重組腺病毒Ad-HGF轉(zhuǎn)染MSCs及其表達的實驗研究
　　構(gòu)建攜帶HGF基因的重組腺病毒(Ad-HGF),然后轉(zhuǎn)染MSCs;采用Q-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中HGFmRNA的表達水平,ELISA檢測轉(zhuǎn)染后細

7、胞中HGF蛋白的表達,MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細胞上清液對MSCs生長增殖的影響,AnnexinV/PI流式細胞術(shù)及Western-Blot法檢測HGF表達對缺氧環(huán)境下MSCs細胞凋亡的影響。結(jié)果:成功構(gòu)建了Ad-HGF重組腺病毒;轉(zhuǎn)染MSCs的最佳MOI為200,腺病毒載體轉(zhuǎn)染48h后即可達到轉(zhuǎn)染的最大比例;轉(zhuǎn)染后的MSCs可以在mRNA及蛋白水平上表達高水平的HGF基因;轉(zhuǎn)染后細胞上清液分泌的HGF可促進MSCs的生長增殖;轉(zhuǎn)染后的MSC

8、s在缺氧環(huán)境下能通過增加Bcl-2蛋白的表達,同時降低Bax、Caspase-3蛋白的表達來減少細胞凋亡。結(jié)論:Ad-HGF修飾可促進細胞的生長增殖,有效減少缺氧環(huán)境下細胞凋亡的發(fā)生。
　　第四部分小分子水凝膠對MSCs增殖、存活和分化的作用研究
　　通過MTT及AO/EB染色等方法檢測細胞在水凝膠中的生長情況,通過AnnexinV/PI流式細胞術(shù)及Western印跡法等分析在缺氧環(huán)境下水凝膠對MSCs凋亡的影響,采用Q-P

9、CR、Western印跡法及免疫細胞熒光化學(xué)染色等分析對5-aza誘導(dǎo)下MSCs在水凝膠內(nèi)的分化情況。結(jié)果:MSCs在SMHs中能夠保持良好的增殖能力及活力,存活細胞數(shù)目較高;缺氧環(huán)境下,SMHs組的細胞凋亡或壞死的細胞數(shù)目明顯少于MSCs組,SMHs組的細胞可能通過增加Bcl-2、降低Bax、Caspase-3等蛋白的表達來減少凋亡;5-aza誘導(dǎo)下,SMHs組的NKx2.5、GATA-4mRNA及cTnT蛋白的表達較MSCs組明顯增

10、加,免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,5-aza誘導(dǎo)下,SMHs組的cTnT、desmin及Cx-43表達較MSCs組明顯增強。結(jié)論:證實了小分子水凝膠具有促進細胞生長增殖、提高缺氧環(huán)境下MSCs的存活及增強5-aza誘導(dǎo)MSCs向心肌細胞分化的作用。
　　第五部分小分子水凝膠攜帶Ad-HGF/MSCs心梗移植的實驗研究
　　本部分研究中,我們以SMHs攜帶經(jīng)Ad-HGF修飾后的MSCs進行心梗移植治療。首先通過非侵襲性生物發(fā)光成像

11、技術(shù)對移植細胞的滯留及存活進行監(jiān)測,并利用TUNEL染色進行細胞凋亡檢測、通過超聲心動學(xué),血流動力學(xué)對移植后心臟結(jié)構(gòu)與功能的改善情況進行檢測,利用組織學(xué)與免疫熒光染色對移植后梗死心肌室壁厚度及面積、干細胞的分化情況進行評價。結(jié)果:在各時間點的檢測中,SMHs+Ad-HGF/MSCs組生物發(fā)光信號強度均較單純Ad-HGF/MSCs組顯著增加,SMHs可明顯促進干細胞滯留與存活;TUNEL檢測顯示,SMHs+Ad-HGF/MSCs組凋亡細胞

12、數(shù)量顯著減少;DAPI及GFP標(biāo)記的熒光顯微鏡觀察,SMHs能顯著提高移植Ad-HGF/MSCs1周及4周的滯留及存活率;單純注射SMHs或單純注射Ad-HGF/MSCs輕微改善了左心功能,SMHs攜帶Ad-HGF/MSCs可明顯改善左心功能;SMHs攜帶Ad-HGF/MSCs移植可明顯增加室壁厚度及縮小心梗面積;SMHs+Ad-HGF/MSCs移植組新生的血管數(shù)量最多;在移植后4周內(nèi),部分移植的Ad-HGF/MSCs在心肌環(huán)境下向心肌