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文檔簡介
1、研究目的:
1.觀察丹酚酸B(SalB)和重組腺病毒Ad-HGF感染對MSCs的存活、增殖以及在缺氧環(huán)境下抗凋亡能力的影響;
2.探討SalB和重組腺病毒Ad-HGF感染誘導MSCs分化為心肌樣細胞的影響。
研究方法:
1.用貼壁培養(yǎng)法分離純化大鼠骨髓MSCs;
2.Ad-HGF感染MSCs,流式細胞儀檢測最佳感染復數(shù)(MOI),RT-Q-PCR檢測感染后細胞中HGFmRNA的表達;EL
2、ISA法檢測感染后細胞上清液HGF的水平;
3.AO/EB雙重熒光染色檢測細胞的存活,實驗分4組:單純MSCs組、Ad-HGF組、SalB組和SalB+Ad-HGF組,各組作用細胞后第1天,進行AO/EB染色,熒光顯微鏡下觀察;用MTT比色法檢測細胞的增殖情況;
4.流式細胞儀檢測細胞凋亡,實驗分5組:常氧MSCs組、缺氧MSCs組、缺氧Ad-HGF組、缺氧SalB組、缺氧SalB+Ad-HGF組,AnnexinV/
3、PI雙染法流式細胞儀檢測細胞凋亡;蛋白印跡法檢測細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達;
5.觀察SalB和Ad-HGF感染誘導MSCs分化為心肌樣細胞的情況,分組用5-Aza、Ad-HGF、SalB、5-Aza+SalB、5-Aza+Ad-HGF和SalB+Ad-HGF作用于MSCs,單純MSCs作為陰性對照組,5-Aza作為陽性對照組,培養(yǎng)至3w倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化;細胞免疫熒光檢測細胞特異性蛋白
4、cTnT、Desmin、Connexin43的表達;蛋白印跡法檢測心肌細胞特異性蛋白cTnT的表達;熒光定量PCR檢測早期心肌細胞特異標志物GATA-4和Nkx2.5的表達。
實驗結(jié)果:
1.成功分離純化骨髓間充質(zhì)干細胞,細胞接種24h后開始貼壁,呈較大的橢圓形,48h后細胞貼壁逐漸增多,呈均勻一致的長梭狀,并逐漸形成集落;
2.Ad-HGF按不同MOI感染后細胞生長良好,MOI=200時細胞感染效率最高(
5、89.08%),可檢測出HGFmRNA的表達,在細胞上清液檢測到HGF穩(wěn)定表達,持續(xù)約21d;
3.AO/EB雙重熒光染色顯示Ad-HGF組和SalB組對MSCs的存活與對照組比較無明顯差異;MTT示Ad-HGF組和SalB組對MSCs的增殖(OD值)與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05),兩者聯(lián)合效果更明顯(P<0.05);然而,5-Aza組OD值明顯較對照組小(P<0.05);
4.在缺氧環(huán)境下,Ad-HGF組
6、和SalB組與單純MSCs組相比可有效抑制缺氧誘導的細胞凋亡,增加細胞的存活率(P<0.05);在蛋白水平上上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達,與對照組相比較有統(tǒng)計學意義,并且兩者聯(lián)合作用效果更明顯(P<0.05);
5.誘導后,MSCs體積逐漸增大,形態(tài)變圓,2-3w時可見部分細胞胞體粗大,胞漿粗糙,在5-Aza+SalB組、5-Aza+Ad-HGF組和SalB+Ad-HGF組較5
7、-Aza組明顯,但單獨Ad-HGF組和SalB組形態(tài)改變不明顯;免疫熒光化學染色檢測顯示經(jīng)SalB作用和Ad-HGF感染誘導后的細胞表達心肌細胞特異性蛋白cTnT、Desmin和Connexin43,蛋白印跡法示cTnT特異性條帶,熒光定量PCR見Nkx2.5和GATA-4陽性表達,在5-Aza+SalB組、5-Aza+Ad-HGF組和SalB+Ad-HGF組表達較5-Aza組強,而SalB和Ad-HGF較5-Aza組弱,但較單純MSC
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