耳聾-甲發(fā)育不全(DDOD)綜合征分子致病機制及西南地區(qū)聾病分子流行病學研究.pdf

1、第一部分DDOD綜合征致病機制研究
　　背景：DDOD綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳病,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。已明確該綜合征的責任基因為 ATP6V1B2,其致病機制尚不清楚。為了進一步明確DDOD綜合征的致病機制,我們對山西的一個DDOD綜合征家系進行了分子致病機制的研究。方法：通過對DDOD綜合征家系的先證者及其家人進行Sanger測序明確DDOD綜合征的責任基因突變,通過相對定量PCR研究ATP6V1B2的轉(zhuǎn)錄水平的變

2、化。結果：先證者攜帶有ATP6V1B2的新生無義突變c.1516C>T,其父母及弟弟均未攜帶該突變。相對定量PCR研究中,先證者與其父母相比,轉(zhuǎn)錄水平無明顯改變,與其弟弟相比,轉(zhuǎn)錄水平有差異。結論：證實該DDOD綜合征家系的致病原因為ATP6V1B2第14外顯子發(fā)生了新生無義突變c.1516C>T。且基因突變后轉(zhuǎn)錄水平無明顯改變。
　　第二部分ATP6V1B2突變的致聾機制研究
　　背景：ATP6V1B2編碼的蛋白ATP6V

3、1B2為ATPase的一個亞基,在人體廣泛表達,已證實ATP6V1B2的突變?yōu)镈DOD綜合征的主要致病原因,其發(fā)病機制不清楚。為了進一步明確ATP6V1B2在聽覺形成中的作用。我們在mRNA水平及蛋白水平對不同發(fā)育階段的小鼠耳蝸進行了研究。方法：選用不同發(fā)育階段(E17,E19,P1,P7,P14,P21,P30)的小鼠,取出耳蝸,行冰凍切片,采用免疫組化法及免疫熒光染色法研究 Atp6vb2在小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育過程中的蛋白表達。采用

4、原位雜交方法研究 Atp6vb2在小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄水平變化。構建野生型與突變型ATP6V1B2表達載體,轉(zhuǎn)染HEK293細胞,鑒定ATPase的水解活性及轉(zhuǎn)運功能。結果：免疫熒光法顯示:ATP6V1B2在昆明小鼠耳蝸Corti’s器的內(nèi)毛細胞、外毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)上均有明顯表達,在內(nèi)外毛細胞上的熒光與MYO7A的熒光相吻合,在螺旋神經(jīng)節(jié)上的綠色熒光與Neurofilament的熒光位置相吻合。小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中ATP6V

5、1B2表達位置比較恒定。采用免疫組化法檢測了ATP6V1B2在昆明小鼠耳蝸的表達分布情況。結果與免疫熒光染色結果一致。均表現(xiàn)為在小鼠耳蝸內(nèi)外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)存在ATP6V1B2表達。探針組螺旋神經(jīng)節(jié)及內(nèi)外毛細胞染色較深,陰性對照未著色。說明在mRNA水平,ATP6V1B2在出生后第二天的昆明小鼠耳蝸的螺旋神經(jīng)節(jié)及內(nèi)外毛細胞有表達,這與我們之前的免疫組化的結果相吻合。ATPase的實驗顯示隨著突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例的提高,轉(zhuǎn)染細胞的ATPas

6、e的水解活性顯著減低。轉(zhuǎn)染細胞的溶酶體pH值在增加,說明隨著突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例的提高,ATPase質(zhì)子泵的轉(zhuǎn)運活力在下降。結論：通過對不同發(fā)育階段的小鼠耳蝸切片進行免疫熒光及免疫組化染色,在蛋白水平明確了ATP6V1B2在小鼠耳蝸表達,主要表達部位為耳蝸的內(nèi)外毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)元;在小鼠耳蝸的發(fā)育過程中,ATP6V1B2表達部位穩(wěn)定,說明Atp6v1b2在聽覺形成中具有重要的功能。通過RNA原位雜交,首次在mRNA水平證實Atp6v

7、1b2在小鼠耳蝸表達,表達部位為耳蝸的內(nèi)外毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié),與免疫組化及免疫熒光的實驗結果相一致。通過構建ATP6V1B2基因野生型、c.1516C>T突變型和PEGFP基因的真核共表達載體,并轉(zhuǎn)染 HEK293細胞,進一步對 V-ATPase的水解及轉(zhuǎn)運活性鑒定,發(fā)現(xiàn)隨著突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例的提高,轉(zhuǎn)染細胞的ATPase的水解活性顯著減低。轉(zhuǎn)染細胞的溶酶體pH值在增加,說明隨著突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例的提高,ATPase質(zhì)子泵的轉(zhuǎn)運活力在下降。

8、在功能學上初步證實該突變能影響V-ATPase的水解活性,繼而影響靠ATP水解提供能量進行的 H+離子轉(zhuǎn)運功能,造成溶酶體內(nèi)酸度減低。
　　第三部分西南地區(qū)非綜合征型聾分子流行病學研究
　　背景：在我國,每年有30,000個聾兒出生。位于中國西南部的云南,由52個民族組成,是人類文明的重要起源地,對該地區(qū)耳聾致病因素知之甚少。為該區(qū)域的耳聾患者及其家人提供有效的耳聾風險評估和基因咨詢,我們對云南省華夏中專特教學校非綜合征型耳

9、聾患者的常見分子病因進行了調(diào)查。方法：對云南省華夏中專特教學校的235名耳聾患者的GJB2、SLC26A4和mtDNA12S rRNA突變進行了分析。并對包括攜帶有SLC26A4突變的16例患者、未攜帶任何SLC26A4突變的37例少數(shù)民族和47例漢族在內(nèi)的共100例患者進行顳骨CT掃描。結果：GJB2在少數(shù)民族的檢出率為16.67％(7/42),漢族的檢出率為17.62%(34/193),二者沒有明顯差異(P>0.05)。235del

10、C為非綜合征型聾的熱點突變。首次在漢族非綜合征型聾患者中發(fā)現(xiàn)了431_450del19突變,其使終止密碼子提前出現(xiàn),蛋白結構改變。SLC26A4在少數(shù)民族的檢出率為9.52%(4/42),漢族的檢出率為9.84%(19/193),兩組沒有明顯差異(P>0.05)。mtDNA12S rRNA在少數(shù)民族和漢族的檢出率分別為11.90%(5/42)和7.77%(15/193),二者相比沒有明顯差異(P>0.05)。在16例攜帶有SLC26A4