miRNA-4530在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中作用的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究：
　　第一部分 miR-4530靶基因的預(yù)測(cè)分析及3'UTR驗(yàn)證
　　目的：
　　通過生物信息學(xué)軟件TargetScanHuman6.2預(yù)測(cè)分析miR-4530的靶基因并篩選出作為研究對(duì)象的靶基因，將miR-4530質(zhì)粒與攜帶有靶基因的3'UTR序列的熒光素酶報(bào)告載體(psiCHECK-2)的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞（293T細(xì)胞），利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性，分析miR-

2、4530與靶基因之間是否存在靶向性的結(jié)合。
　　方法：
　　1)使用生物信息學(xué)軟件TargetScaHuman6.2預(yù)測(cè)分析，篩選出與miR-4530相關(guān)性最高的5個(gè)靶基因。
　　2)將含有已確定靶基因的3'UTR的重組質(zhì)粒分別與miR-4530質(zhì)粒、NC質(zhì)粒和空白對(duì)照（不含質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。
　　3)通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-4530與相應(yīng)靶基因是否存在靶向性結(jié)合關(guān)系。
　　結(jié)果：

3、r>　　1)通過生物信息學(xué)軟件TargetScanHuman6.2篩選出miR-4530對(duì)應(yīng)的5個(gè)相關(guān)性高的靶基因包括:RASA1(RAS p21 protein activator1)、PTCD3(Pentatricopeptide repeat domain3)、PANK1(Pantothenate kinase1)、FGFR1(Fibroblast growth factor receptor1)和VASH1(Vasohibin1

4、)，通過查閱文獻(xiàn)并確定VASH1為靶基因。
　　2)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性分別與NC組和對(duì)照組相比，熒光素酶的活性均出現(xiàn)降低，有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001v.s.NC，P＜0.001 v.s.空白對(duì)照)。
　　結(jié)論：
　　篩選出miR-4530可能的5個(gè)相關(guān)性高的靶基因，并通過查閱文獻(xiàn)，最終確定靶基因?yàn)閂ASH1。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，過表達(dá)miR-4530質(zhì)粒可以與VASH

5、1的3'UTR全序重組質(zhì)粒特異性結(jié)合，并抑制下游熒光素酶的表達(dá)，確定VASH1是miR-4530的直接靶向基因。
　　第二部分 miR-4530對(duì)HUVEC細(xì)胞管腔形成的影響
　　目的：
　　將miR-4530 mimics、mimics NC、miR-4530 inhibitor、inhibitor NC分別轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞后，通過基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)觀察miR-4530是否對(duì)HUVEC細(xì)胞管腔形成能力產(chǎn)生影響。

6、　　方法：
　　1)通過HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同濃度NC-FAM，觀察轉(zhuǎn)染后的熒光確定最適合的轉(zhuǎn)染濃度。
　　2) HUVEC細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-4530 mimics、mimics NC、miR-4530 inhibitor、inhibitor NC與空白對(duì)照。
　　3)用Matrigel基質(zhì)膠孵育轉(zhuǎn)染完成的HUVEC細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染miR-4530 mimics和miR-4530 inhibitor后對(duì)HUVEC細(xì)胞管

7、腔形成能力的影響，來驗(yàn)證過表達(dá)miR-4530和抑制miR-4530分別對(duì)HUVEC細(xì)胞生物學(xué)功能的作用。
　　結(jié)果：
　　1)通過觀察HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC-FAM的熒光強(qiáng)度，確定最適的轉(zhuǎn)染濃度為6孔板中30 pmol/孔。
　　2) HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-4530 mimics、mimics NC、miR-4530 inhibitor、inhibitorNC與空白組后，通過Matrigel基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)，觀察到

8、轉(zhuǎn)染miR-4530 mimics組分別與mimics NC組和對(duì)照組相比管腔的形成數(shù)量減少，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05 v.s.mimics NC，P＜0.05 v.s.空白對(duì)照）。轉(zhuǎn)染miR-4530 inhibitor組分別與inhibitor NC組和對(duì)照組相比管腔的形成數(shù)量增加，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05 v.s.inhibitor NC，P＜0.05 v.s.空白對(duì)照)。
　　結(jié)論：
　　通過Matrigel

9、基質(zhì)膠培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞的管腔形成能力實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-4530可以抑制管腔形成，抑制miR-4530可以促進(jìn)管腔形成。說明轉(zhuǎn)染miR-4530的確對(duì)HUVECs的管腔形成的能力產(chǎn)生了影響。
　　第三部分 HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-4530和miR-4530Sponge對(duì)VASH-1表達(dá)情況的影響
　　目的：
　　miR-4530增強(qiáng)子質(zhì)粒、miR-4530 Sponge抑制子質(zhì)粒和NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞

10、，分別在VASH1的mRNA和蛋白水平驗(yàn)證miR-4530對(duì)其表達(dá)情況的影響。
　　方法：
　　1)使用滅瘟素篩選HUVEC細(xì)胞，確定最適合的篩選濃度。
　　2)轉(zhuǎn)染miR-4530增強(qiáng)子質(zhì)粒、miR-4530 Sponge抑制子質(zhì)粒和NC質(zhì)粒，通過使用滅瘟素篩選，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞株。
　　3)篩選出miR-4530過表達(dá)、低表達(dá)和NC細(xì)胞株后，通過熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞株miR-4

11、530的表達(dá)情況、VASH1的mRNA水平的變化和VASH1蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1)根據(jù)滅瘟素篩選的結(jié)果，確定滅瘟素濃度12μl/ml為HUVEC細(xì)胞的最適篩選濃度。
　　2) HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-4530增強(qiáng)子、miR-4530 Sponge與NC組后，轉(zhuǎn)染miR-4530組和miR-4530 Sponge組與NC組相比在miR-4530水平分別明顯升高和降低，存在非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.0

12、01 miR-4530 v.s.NC，P＜0.001miR-4530 Spongev.s.NC)。在mRNA水平，轉(zhuǎn)染miR-4530組和miR-4530Sponge組與NC組相比VASH1的mRNA水平分別明顯降低和升高，存在非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001 miR-4530 v.s.NC，P＜0.01 miR-4530 Sponge v.s.NC)。在蛋白水平，可以看到蛋白的變化有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01miR-4530

13、v.s.NC, P＜0.05 miR-4530 Sponge v.s.NC)。
　　結(jié)論：
　　HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-4530增強(qiáng)子、miR-4530 Sponge與NC組后，與NC組相比在miR-4530組和miR-4530 Sponge組中miR-4530的水平分別升高和降低，說明轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒在HUVEC細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。在mRNA水平，轉(zhuǎn)染miR-4530組和轉(zhuǎn)染miR-4530 Sponge組與NC組相比VASH1的