SMP30、CNN2與GP73三種HCC相關(guān)抗原對肝細胞性肝癌診斷價值的研究.pdf

1、研究背景：肝細胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）和乙型肝炎在我國有很高的發(fā)病率和死亡率，廣西是這兩種疾病的高發(fā)區(qū)。目前對肝癌的診斷手段主要有臨床檢查、影像、病理檢查，但由于肝癌早期臨床癥狀體征不明顯，一旦發(fā)現(xiàn)多為晚期。因此，尋找肝癌早期血清檢測標記物并進行簡單有效的檢測是本課題研究的重點內(nèi)容。目前檢測HCC的血清標記物主要是甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP），但是其靈敏度并不能讓人滿

2、意。目前有大量報道稱幾種指標的聯(lián)合檢測對疾病的檢出率有明顯提高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，抗衰老標記蛋白-30(senescence marker protein-30，SMP30）抗體和抗中性調(diào)寧蛋白（H2-calponin，CNN2）抗體主要見于HCC病人，但是對HCC患者血清中SMP30、C NN2蛋白水平的檢測目前沒有報道。同時已有大量報道稱高爾基體糖蛋白（ Golgi protein-73，GP73）對肝癌的檢出率比較高且與AFP

3、有很好的互補性。
　　研究目的：探討血清SMP30、CNN2、GP73蛋白含量對HCC的診斷價值及分析三種蛋白和AFP聯(lián)合檢測對HCC診斷的臨床意義，為HCC診斷提供更好的選擇。研究方法：利用本課題組構(gòu)建并保存于-80℃的基因工程菌BL21-pET30a-SMP30、BL21-pColdⅢ-CNN2表達純化得到高純度的SMP30蛋白和CNN2蛋白，并以此作為標準蛋白，分別建立雙抗體夾心ELISA，同時購買GP73檢測試劑盒，檢測原

4、發(fā)性肝癌患者、慢性乙肝患者、慢性乙肝攜帶者、肝硬化患者及正常人血清中SMP30、CNN2、GP73蛋白含量。
　　研究結(jié)果：1.表達純化的SMP30濃度為0.6mg/mL,純度為92.82％，雙抗體夾心ELISA包被抗體（兔抗人SMP30多克隆抗體）、檢測抗體一抗（鼠抗人SMP30單克隆抗體）以及酶標二抗（羊抗鼠lg G-HRP）的最佳工作稀釋比例分別為1∶200,1∶400,1∶5000,血清最佳稀釋比例為1：5，標準曲線的回歸

5、方程為:y=1.673x+0.025,R2=0.996，P<0.001,標準蛋白在3.6～500ng/mL之間有很好的的劑量效應(yīng)關(guān)系。批內(nèi)和指間變異系數(shù)分別為8%和12%。HCC組、肝炎組、健康組的陽性率分別為8.4%（21/250）、0.6%（1/170）、1.4%（3/217)，HCC陽性率高于肝炎組（P<0.001）和健康組（P=0.001），尚不能認為肝炎組和健康組的陽性率有差別（P=0.795）。HCC組血清標本SMP30蛋白

6、含量明顯高于正常對照組( P=0.002)和肝炎組（ P=0.001),正常對照組與肝炎組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.503)。該方法的敏感度為8.4%,特異度為98.86%。血清中SMP30蛋白含量與HCC患者的年齡、AFP含量、肝功能、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤病理等臨床指標無顯著性相關(guān)。
　　2.雙抗體夾心ELISA包被抗體（羊抗人CNN2多克隆抗體）、檢測抗體一抗（兔抗人CNN2多克隆抗體）以及酶標二抗（羊抗兔lg G-HRP

7、）的最佳工作稀釋比例分別為1∶200,1∶2000,1∶5000,血清最佳稀釋比例為1：10。檢測結(jié)果，HCC組、健康組和肝炎組的陽性率分別為2.1%（3/143)、2.8%(6/217)和2.4%(4/170)。三組的CNN2蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義。該方法的敏感度為2.4%,特異度為97.2%。血清中CNN2蛋白含量與臨床指標之間尚不能確定有關(guān)。
　　3.血清GP73蛋白水平在HCC、肝硬化、慢性乙肝、慢性乙肝攜帶者、健康人分

8、別為88.09±64.13、184.20±88.70、149.53±89.76、39.32±8.99和25.27±12.221(ng/mL)。健康組中，血清GP73蛋白水平在不同性別中沒有差別（P=0.819）；HCC組中，男患者血清GP73蛋白水平高于女患者（P=0.001），有肝硬化的患者高于無肝硬化的患者（P=0.002），腫瘤直徑>3cm的患者高于腫瘤直徑≤3cm的患者（P=0.020)。GP73診斷HCC的臨界值為61.93n

9、g/mL，特異度為98.56%，靈敏度為56.93%。
　　4.多個HCC相關(guān)抗原同時檢測可以顯著提高HCC的檢出率。聯(lián)合檢測價值最高的組合為AFP+GP73,陽性率為82.35%。
　　結(jié)論：1.成功建立了雙抗體夾心ELISA檢測人血清SMP30蛋白，所建立的ELISA方法，批內(nèi)批間差異和穩(wěn)定性均滿足實驗要求。HCC血清SMP30檢出率大于健康組和肝炎組，提示SMP30有望成為一種新的肝癌血清標志物。
　　2.HCC