Mdr1在腫瘤化療中療效及骨髓保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分多藥耐藥基因1 （MDRl）的克隆及構(gòu)建表達(dá)MDRl的重組腺病毒 目的：克隆多藥耐藥基因1(MDR1)至腺病毒質(zhì)粒載體中并導(dǎo)入包裝細(xì)胞，產(chǎn)生表達(dá)目的基因的重組腺病毒。 方法：PCR法體外克隆出目的基因并將該基因采用定向克隆的方法克隆進(jìn)入穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中，采用同源重組方法將該質(zhì)粒和腺病毒質(zhì)粒Adeasy-1連接，最后通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法導(dǎo)入包裝細(xì)胞HEK293中，產(chǎn)生表達(dá)目的基因的重組腺病毒。

2、 結(jié)果：(1)PCR法克隆出目的基因MDR1，并通過基因測(cè)序篩選出正確的克隆，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pAdTrack-MDR1；(2)將MDR1基因克隆進(jìn)入腺病毒質(zhì)粒載體中形成重組腺病毒質(zhì)粒Adeasy-MDR1，并將重組腺病毒質(zhì)粒Adeasy-MDR1導(dǎo)入包裝細(xì)胞HEK293中形成表達(dá)mdr1的高滴度重組腺病毒Ad5-MDR1。(3)收獲的病毒感染液滴度達(dá)8.3×10<'11>pfu/ml結(jié)論：克隆出正確的MDR1基因并重組含有目的基因

3、MDR1的腺病毒，收獲高滴度重組腺病毒Ad5-MDR1，為進(jìn)一步的研究打下了良好的基礎(chǔ)。 第二部分多藥耐藥(mdrl)基因轉(zhuǎn)染C57和Balb/c小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究 目的：建立一套完整、穩(wěn)定、高效的體外基因轉(zhuǎn)染體系將外源性mdr1基因?qū)隒57和Balb/c小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染后mdr1基因在靶細(xì)胞中功能性表達(dá)情況，為進(jìn)一步將轉(zhuǎn)染的骨髓細(xì)胞移植保護(hù)受體骨髓免受大劑量化療藥物的損傷實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

4、 方法：采用乒乓交互感染收集并濃縮病毒上清，采用濃縮病毒上清轉(zhuǎn)染法將mdr1基因?qū)肽[瘤壞死因子α(TNF-α)預(yù)處理后的C57和Balb/c小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，采用RT-PCR法、Western-blot分別從基因、蛋白質(zhì)水平檢測(cè)mdr1基因在小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的功能性表達(dá)，柔紅霉素排出試驗(yàn)從功能水平檢測(cè)mdr1基因在小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的功能性表達(dá)情況，探討轉(zhuǎn)染時(shí)間和轉(zhuǎn)染效率、功能之間的關(guān)系。 結(jié)果：(1)建立了一套完整

5、、穩(wěn)定、高效的mdr1基因體外轉(zhuǎn)染體系；(2)流式細(xì)胞儀測(cè)得體外轉(zhuǎn)染率可達(dá)到26.26％，(3)柔紅霉素排出試驗(yàn)證實(shí)導(dǎo)入的mdr1基因表達(dá)產(chǎn)物P-gp有藥物外排泵功能。(4)RT-PCR法證實(shí)外源性mdr1基因有效地在小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞基因組表達(dá)；(5)Western-blot測(cè)得轉(zhuǎn)染后P-糖蛋白(P-glycoprotein P-gp)表達(dá)較轉(zhuǎn)染前明顯增高； 結(jié)論：通過腺病毒載體可在體外將外源性mdr1基因有效的轉(zhuǎn)入小鼠骨髓單

6、個(gè)核細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染的mdr1基因能有效地在靶細(xì)胞基因組中表達(dá)，為進(jìn)一步移植轉(zhuǎn)染細(xì)胞保護(hù)骨髓免受大劑量化療損傷的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。 第三部分mdrl基因轉(zhuǎn)染骨髓移植聯(lián)合超劑量化療治療Lewis肺癌和4T1乳腺癌小鼠的研究 目的：本研究旨在通過mdr1基因轉(zhuǎn)染的骨髓造血細(xì)胞移植來提高C57和BNb/c小鼠肺癌和乳腺癌骨髓對(duì)化療的耐受性，然后觀察超劑量化療中mdr1基因的骨髓保護(hù)及腫瘤治療作用；并監(jiān)測(cè)外源性mdr1基因在受體骨髓

7、內(nèi)表達(dá)的情況。 方法：將小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞與含有人全長(zhǎng)mdr1 cDNA的腺病毒共培養(yǎng)4日后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)骨髓腔注射移植入經(jīng)<'60>CO放療預(yù)處理的Lewis肺癌和4T1乳腺癌荷瘤小鼠體內(nèi)，然后進(jìn)行超劑量表阿霉素化療實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)mdr1基因?qū)κ荏w骨髓的保護(hù)作用、超劑量化療對(duì)腫瘤的治療作用。同時(shí)采用RT-PCR法、Western blot法分別從基因、蛋白水平檢測(cè)外源性mdr1基因在受體骨髓的表達(dá)情況。 結(jié)果：(1)采用培

8、養(yǎng)細(xì)胞移植法成功建立Lewis肺癌和4T1乳腺癌動(dòng)物模型；(2)采用骨髓腔內(nèi)注射移植將轉(zhuǎn)染mdr1基因的骨髓單個(gè)核細(xì)胞回輸入荷瘤小鼠，受體骨髓中有外源性mdr1基因的功能性表達(dá)；(3)超劑量化療實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染mdr1基因的荷瘤小鼠能耐受3倍劑量表阿霉素的化療，外周血白細(xì)胞可維持在正常范圍，同時(shí)腫瘤能被有效治療，荷瘤動(dòng)物的生存時(shí)間及生存質(zhì)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組荷瘤動(dòng)物死于超劑量化療所造成的嚴(yán)重骨髓抑制或腫瘤擴(kuò)散。