建立安全有效的豬的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞.pdf

1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）是體細(xì)胞經(jīng)過重編程而來的一類多能干細(xì)胞。重編程可以通過核移植、過表達(dá)外源性轉(zhuǎn)錄因子、添加小分子等方法誘導(dǎo)啟動(dòng)。因?yàn)閕PS細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)一樣可以分化成任何類型的體細(xì)胞，而且克服了分離ES細(xì)胞需要破壞胚胎等倫理道德的問題，所以iPS細(xì)胞的研究在再生醫(yī)學(xué)中有著巨大的潛力。雖然已經(jīng)有很多文章報(bào)道了提高iPS細(xì)胞誘導(dǎo)效率的方法，但是如何有效的生成統(tǒng)一的高質(zhì)量的iPS細(xì)胞仍然是一個(gè)難題。在生理解剖方面，豬比

2、小鼠更接近人類，所以豬已經(jīng)成為重要的人類疾病研究的大動(dòng)物模型。因此，建立高質(zhì)量的豬iPS細(xì)胞將極大地促進(jìn)干細(xì)胞的研究和治療，并且豬的iPS細(xì)胞可以通過核移植和嵌合體等方法深入驗(yàn)證iPS細(xì)胞的安全性和有效性。
　　本研究的目的是建立高質(zhì)量的豬iPS細(xì)胞，將豬作為動(dòng)物模型為iPS細(xì)胞的臨床前研究服務(wù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要包括四個(gè)方面:(1)建立高質(zhì)量的小鼠的iPS細(xì)胞系，并優(yōu)化小鼠iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，為豬iPS細(xì)胞的研究打下基礎(chǔ)。(2)通過

3、優(yōu)化誘導(dǎo)方法，獲得高質(zhì)量的豬的iPS細(xì)胞系。(3)檢驗(yàn)豬iPS細(xì)胞的多能性，包括嵌合體豬的制備。(4)研究豬的iPS細(xì)胞重編程和維持的分子機(jī)制。
　　通過六年的博士研究，取得以下創(chuàng)新性結(jié)果:(1)和血清(FBS)相比，血清替代物(KSR)可以提高誘導(dǎo)小鼠iPS細(xì)胞的質(zhì)量，利用KSR誘導(dǎo)建立的小鼠iPS細(xì)胞更有利于生成完全來源于iPS細(xì)胞的嵌合體后代，并有生殖系轉(zhuǎn)移。MAPK/ERK通路抑制劑(PD0325901)可顯著增加誘導(dǎo)過程

4、中內(nèi)源基因的激活。(2)我們系統(tǒng)的比較并優(yōu)化了豬iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)方法。優(yōu)化方法包括:采用不同的過表達(dá)方法、不同的細(xì)胞類型、不同的多能因子組合和誘導(dǎo)培養(yǎng)條件等。我們發(fā)現(xiàn)采用優(yōu)質(zhì)的前體細(xì)胞和持續(xù)的過表達(dá)外源基因有利于能得到內(nèi)源大量激活的細(xì)胞系(3)通過挑選了約2059個(gè)克隆，我們建立豬的iPS細(xì)胞系16株，并檢驗(yàn)了這些細(xì)胞系的多能性。我們發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的豬的iPS細(xì)胞內(nèi)源基因大量激活，可以在體外形成擬胚體并有三胚層分化，注射到免疫缺陷的小鼠中可以

5、有效地形成有三個(gè)胚層的畸胎瘤。值得注意的是，高質(zhì)量的豬的iPS細(xì)胞可以產(chǎn)生嵌合豬。這些結(jié)果說明我們建立的豬的iPS細(xì)胞具有一定的多能性。(4)此外，利用兩個(gè)豬的多能因子和小分子組合，我們生成了具有部分多能性的豬的iPS細(xì)胞。這證明減少外源因子不利于內(nèi)源基因的激活。(5)利用RNA-seq的方法比較了豬iPS細(xì)胞和前體細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組上的差別，結(jié)合多能性檢測，發(fā)現(xiàn)Rex1指示高質(zhì)量的豬的iPS細(xì)胞系，同時(shí)也分析了誘導(dǎo)前后表觀遺傳學(xué)上的變化規(guī)律。