RhoA與2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈病變的關(guān)系及辛伐他汀干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：糖尿病大血管病變是對2型糖尿病(type 2diabetes mellitus，T2DM)患者危害最大的慢性并發(fā)癥，它可以導(dǎo)致冠心病、腦血管疾病、四肢壞疽，致殘致死率高。由多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)參與的非特異性炎癥—?jiǎng)用}粥樣硬化是其病理基礎(chǔ)。小G蛋白R(shí)hoA是一類重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中介分子，其主要作用是水解鳥氨酸。激活后的RhoA通過激活其下游靶分子—Rho激酶(ROCK)調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為與功能，包括細(xì)胞骨架的組裝、轉(zhuǎn)錄因子的激

2、活、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、平滑肌細(xì)胞的收縮遷移、細(xì)胞因子的分泌等。Rho蛋白都是在羧基末端被異戊烯化，通過這種異戊烯化作用引起活化的GTP結(jié)合形式的Rho蛋白移位到胞膜，繼而和它的效應(yīng)蛋白作用產(chǎn)生下游反應(yīng)。Rho蛋白的異戊烯化可被他汀類藥物抑制。以往對他汀類藥物的調(diào)脂作用研究較多，但近年來已認(rèn)識(shí)到他汀類藥物具有獨(dú)立于調(diào)脂作用之外的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。本研究通過觀察RhoA在大鼠主動(dòng)脈中的表達(dá)，探討RhoA在糖尿病大血管病變中的作用，并給予糖

3、尿病大鼠辛伐他汀干預(yù)治療，探討其對糖尿病大血管病變的防治作用及作用機(jī)制。 方法：從50只SD大鼠中隨機(jī)抽取10只作為正常對照組(A組)，其余作為實(shí)驗(yàn)組。對照組喂以普通飼料，實(shí)驗(yàn)組喂以高糖高脂飼料。4周后再給予實(shí)驗(yàn)組大鼠STZ 30mg/kg腹腔注射。于實(shí)驗(yàn)第6周末選取空腹血糖(FBG)>7.8 mmol/L且伴有胰島素敏感性降低者作為T2DM動(dòng)物模型，并隨機(jī)分為2組，即T2DM模型組(B組)、T2DM辛伐他汀治療組(C組)。實(shí)驗(yàn)

4、共持續(xù)14周。于第6周末心臟取血測定FBG、空腹胰島素(FINS)水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。于第14周末心臟取血測定FBG與血脂。取大鼠主動(dòng)脈，進(jìn)行光鏡(HE染色、Masson染色)、電鏡觀察，計(jì)算主動(dòng)脈橫截面病灶總面積與管壁總面積的比值：離體血管實(shí)驗(yàn)檢測血管彈性；應(yīng)用免疫組化方法檢測RhoA在主動(dòng)脈組織中的蛋白表達(dá)水平。使用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算RhoA的積分光密度(IOD)值。使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理

5、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，兩組比較采用t/t’檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，相關(guān)分析采用直線相關(guān)。結(jié)果1 實(shí)驗(yàn)第6周末各項(xiàng)檢測指標(biāo)：注射STZ兩周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠FBG(12.99±1.16)mmol/L高于正常對照組(5.03±0.69)mmol/L(P<0.01)：FINS 18.79(18.23，19.29)mIU/L與正常對照組18.35(17.95，18.98)mIU/L比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；ISI 0.0048(0.0045，0.0

6、053)低于正常對照組0.0106(0.0103，0.0112)(P<0.01)，至此T2DM模型復(fù)制成功。 2.實(shí)驗(yàn)第14周末生化指標(biāo)：A組大鼠FBG(4.96±0.92)mmol/L，B組大鼠FBG(13.15±1.18)mmol/L及TG、TC、LDL-C、VLDL-C水平均高于A組，HDL-C水平低于A組(均P<0.05)；C組大鼠TG、TC、LDL-C、VLDL-C水平均低于B組，HDL-C水平高于B組(均P<0.05

7、)，F(xiàn)BG(12.70±3.54)mmol/L與B組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 3 組織形態(tài)：HE染色顯示，A組大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜、外膜分界清楚，內(nèi)膜光滑平坦，管腔面內(nèi)皮細(xì)胞扁平完整，緊貼于平直的內(nèi)彈性膜上，中膜彈性膜與平滑肌細(xì)胞平行整齊排列；B組糖尿病大鼠主動(dòng)脈有不同程度的內(nèi)膜增厚病灶，局部主要由排列紊亂的平滑肌組成，病灶表面內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，有的向腔面突起，有的脫落、甚至壞死，內(nèi)彈力板局部厚薄不均或分層，中膜淺層平滑肌細(xì)胞增生，

8、中層彈力板與平滑肌細(xì)胞間排列紊亂，可見隆起于內(nèi)膜表面的增生性動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，表面為纖維組織，內(nèi)膜下可見增生的平滑肌細(xì)胞斷裂、巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞及細(xì)胞外脂質(zhì)、基質(zhì)；C組(辛伐他汀干預(yù)組)，大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚較平坦，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，內(nèi)彈力板較平直，中彈力板與平滑肌細(xì)胞之間較整齊相間排列，且有不同程度的血管平滑肌細(xì)胞增生，接近于正常大鼠動(dòng)脈，可見少量的泡沫細(xì)胞，但無明顯斑塊形成。各組主動(dòng)脈橫截面病灶總面積與管壁總面積比值分別為：A組0.49±

9、0.10％；B組0.91±0.06％；C組0.81±0.13％。B組較A組病變程度明顯加重，C組較B組病變程度明顯減輕，(均P<0.01)。相關(guān)分析表明主動(dòng)脈病變程度與RhoA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.837，P<0.01)。 Masson染色彈性、膠原纖維呈藍(lán)色，胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色，A組大鼠血管彈力膜較薄，彈性纖維分布均勻；B組大鼠彈力膜增厚，彈性纖維卷曲、排列紊亂，可見斷裂，細(xì)胞外膠原纖維明顯增多；C組大鼠血管彈力膜

10、稍微增厚，可見較多的彈性纖維和膠原纖維。 透射電鏡下可見B組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的部分細(xì)胞膜脫落，細(xì)胞質(zhì)水腫，線粒體融合，大量線粒體有空泡現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆?，F(xiàn)象明顯，游離核糖體數(shù)量明顯減少。C組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫，血管內(nèi)皮下層增厚明顯，厚薄不均，細(xì)胞膜缺失、破損。 4 離體血管實(shí)驗(yàn)：取大鼠胸主動(dòng)脈離體灌流并通過生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄張力變化，檢測其對KCI、苯腎上腺素(PE)誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)，對乙酰膽堿(Ach)誘導(dǎo)的舒張反

11、應(yīng)。與A組比較，B、C組主動(dòng)脈環(huán)對KC1、PE誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；對Ach誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)明顯減弱(P<0.01)。與B組相比，C組主動(dòng)脈環(huán)對KC1和PE的收縮反應(yīng)明顯減弱(P<0.01)，對Ach誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。 5 免疫組化染色：圖像分析顯示，B組大鼠RhoA蛋白表達(dá)的IOD值(788.21±13.29)是A組(272.95±18.44)的2.89倍，C組(592.83±71.87)

12、比B組降低了25％(均P<0.05)。相關(guān)分析表明大鼠主動(dòng)脈RhoA.表達(dá)水平與FBG、LDL-C、VLDL、主動(dòng)脈病變程度，及離體主動(dòng)脈環(huán)對60mmol/L KC1的最大收縮反應(yīng)呈正相關(guān)(分別r=0.837、0.648、0.568、0.837和0.913，均P<0.01)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)(r=-0.781，P<0.01)。 結(jié)論 1.動(dòng)脈粥樣硬化是T2DM大血管病變的主要病理基礎(chǔ)。 2.T2DM主動(dòng)脈的收