2型糖尿病大鼠腎臟Toll樣受體4和A20表達(dá)及辛伐他汀干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：隨著生活水平的提高和生活方式的改變，糖尿病(diabetesmellitus，DM)的患病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的重要原因。Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)是Toll蛋白家族的重要成員之一，也是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)Toll相關(guān)蛋白，參與了機(jī)體的多種炎癥和免疫反應(yīng)。研究表明，TL

2、R4與糖尿病本身及糖尿病慢性并發(fā)癥有一定關(guān)系，但對(duì)于TLR4與DN關(guān)系的直接研究相對(duì)較少。鋅指蛋白A20是一種Cys2/Cys2型胞液鋅指蛋白，在炎癥反應(yīng)中，幾乎體內(nèi)所有器官和組織細(xì)胞都能表達(dá)，它的主要作用是限制炎癥反應(yīng)中核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)活性，保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷，是一種內(nèi)源性調(diào)控蛋白。他汀類藥物是臨床上應(yīng)用較多的調(diào)脂類藥物且療

3、效確切，近來有研究表明辛伐他汀有減輕炎癥反應(yīng)的作用，其作用獨(dú)立于降脂作用外。本實(shí)驗(yàn)通過高糖高脂飲食喂養(yǎng)Sprague-Dawlay(SD)大鼠，使大鼠產(chǎn)生高胰島素血癥和胰島素抵抗，后注射小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)破壞大鼠胰島β細(xì)胞，從而復(fù)制2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠模型。應(yīng)用免疫組化法和RT-PCR法檢測(cè)大鼠腎臟中TLR4和A20的表達(dá)情況，揭示TLR4和A2

4、0與DN的關(guān)系；并給予部分糖尿病大鼠進(jìn)行辛伐他汀干預(yù)治療，以探討其對(duì)糖尿病大鼠腎臟的防治作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表從40只SD大鼠中隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組(A組)，喂以普通飼料，其余作為實(shí)驗(yàn)組，給予高糖高脂飼料(普通飼料中加入15％熟豬油、2.5％膽固醇、20％蔗糖)，實(shí)驗(yàn)組大鼠體重逐漸增加，產(chǎn)生胰島素抵抗，4周后腹腔注射小劑量STZ，劑量為30mg/kg，6周后測(cè)空腹血糖(fasting blood

5、 glucose，F(xiàn)BG)和空腹胰島素(fastinginsulin，F(xiàn)INS)水平，選取FBG>7.8 mmol/L且伴有胰島素敏感指數(shù)(insulinsensitivity，ISI)降低者為2型糖尿病模型。將造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病組(B組，13只)和辛伐他汀干預(yù)組(C組，13只)，實(shí)驗(yàn)共14周。于第14周末測(cè)量各組大鼠體重，心臟取血測(cè)定FBG、膽固醇(cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，T

6、G)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high densitylipoprotein cholesterol，HDL-C)、血肌酐(serum creatinine，Cr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、留24h尿測(cè)定尿白蛋白(urinary albumin，UAlb)水平；取大鼠腎臟，稱重并計(jì)算腎臟肥大指數(shù)(KW/

7、BW)；取腎臟組織多聚甲醛固定待光鏡下觀察；應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)腎臟TLR4和A20蛋白的表達(dá)，使用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算TLR4和A20的IHS；用RT-PCR法檢測(cè)腎臟TLR4 mRNA，用Bandscan5.0凝膠分析系統(tǒng)測(cè)定OD值。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組比較采用t/t’檢驗(yàn)，組間比較時(shí)，采用方差分析或秩和檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)第6周末各指標(biāo)結(jié)果：注射STZ兩周后，

8、實(shí)驗(yàn)組大鼠FBG為12.02±1.83 mmol/L，高于正常對(duì)照組的6.16±0.38 mmol/L(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組的FINS為18.37(18.08，19.43)mIU/L，與對(duì)照組的17.75(17.08，18.53)mIU/L比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但糖尿病組的ISI為0.0046(0.0038，0.0052)低于正常對(duì)照組的0.0094(0.0088，0.0095)(P<0.01)，此時(shí)2型糖尿病大鼠模型復(fù)制

9、成功。
　　2.實(shí)驗(yàn)14周末檢測(cè)指標(biāo)A組大鼠FBG5.72±0.43 mmol/L、TG0.78±0.45mmol/L、TC2.40±0.21 mmol/L、LDL-C1.23±0.16mmol/L、HDL-C1.29±0.25 mmol/L、UAlb2.67±0.21ug/24h、Cr59.02±3.02μmmol/L、BUN5.22±0.31 mmol/L、Ccr0.79±0.36 ml/min、RW/BW1.60±0.10；

10、
　　B組大鼠FBG12.37±3.0 mmol/L、TG1.81±0.24 mmol/L、TC5.50±0.82mmol/L、LDL-C2.12±0.11 mmol/L、HDL-C0.53±0.15 mmol/L、UAlb26.31±0.62 ug/24 h、Cr96.20±10.01μmol/L、BUN9.54±0.72 mmol/L、Ccr0.19±0.28 ml/min RW/BW1.90±0.22；
　　C組FBG

11、11.5±2.0 mmol/L、TG1.06±0.31 mmol/L、TC2.93±0.42 mmol/L、LDL-C1.63±0.04 mmol/L、HDL-C1.03±0.11 mmol/L、UAlb16.61±1.02ug/24 h、Cr71.21±5.01μmol/L、BUN6.11±0.72 mmol/L、Ccr0.79±0.35ml/min、RW/BW1.60±0.22；
　　B組大鼠的FBG、TG、TC、LDL-C、

12、UAlb、BUN、Cr、RW/BW水平均高于A組(P<0.05)，HDL-C和Ccr低于A組P<0.01)；C組大鼠的FBG、TG、TC、LDL-C、UAlb、BUN、Cr、RW/BW水平均低于B組，而HDL-C、Ccr水平高于B組(P<0.05)。
　　3.腎臟HE染色：A組腎小球形態(tài)規(guī)整，腎小球內(nèi)細(xì)胞排列規(guī)則，腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)基底膜清晰規(guī)整；B組腎小球體積明顯增大，腎小球內(nèi)細(xì)胞明顯增多；C組腎小球體積有所減小，腎小球內(nèi)細(xì)胞有所

13、減少，但與A組仍有差別。
　　4.腎臟TLR4和A20蛋白表達(dá)：免疫組化圖像分析顯示，B組大鼠腎臟TLR4蛋白表達(dá)的IHS值為7.8±1.3，明顯高于A組的2.0±1.0(P<0.01)，C組大鼠TLR4蛋白表達(dá)的IHS值為4.2±1.3，低于B組(P<0.01)；B組大鼠腎臟A20蛋白表達(dá)的mS值為4.8±.0.8，高于A組的2.0±1.0(P<0.05)，C組大鼠A20蛋白表達(dá)的IHS值為2.8±0.4，低于B組(P<0.05

14、)。
　　5.腎臟TLR4 mRNA的表達(dá)：Bandscan5.0凝膠分析系統(tǒng)顯示，B組大鼠腎臟TLR4 mRNA/β-action mRNA為0.82±0.05，高于A組的0.378±0.025(P<0.01)，C組大鼠TLR4 mRNA/β-action mRNA為0.616±0.043，低于B組(P<0.01)。
　　6.相關(guān)性分析TLR4與24小時(shí)尿蛋白、血肌酐、A20呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.679、0.586、

15、0.576(P均小于0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.T2DM大鼠尿白蛋白、尿素氮、血肌酐、KW/BW水平均高于正常、Ccr低于正常，HE染色顯示腎小球體積明顯增大，腎小球內(nèi)細(xì)胞明顯增多，說明2型糖尿病大鼠已存在糖尿病腎臟病變。
　　2.T2DM大鼠腎臟TLR4表達(dá)增多，提示TLR4參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展；作為NF-κB的負(fù)調(diào)控蛋白的A20表達(dá)增加，提示其對(duì)炎癥反應(yīng)有一定的抑制，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。對(duì)TLR4和