Ⅰ、醛固酮增多癥大鼠血管重構(gòu)發(fā)生機制的實驗研究;Ⅱ、后腹腔鏡下根治性腎切除術(shù)及其應(yīng)用解剖學研究.pdf

1、研究背景：原發(fā)性醛固酮增多癥是引起繼發(fā)性高血壓的常見原因之一，傳統(tǒng)的觀點認為該病在高血壓人群的檢出率約為1%～2%，甚至＜1%，但目前普遍認為其占高血壓人群的比率在10%以上。原發(fā)性醛固酮增多癥分為多種亞型，其中以產(chǎn)醛固酮的腎上腺腺瘤（APA）和特發(fā)性醛固酮增多癥（IHA）最為常見。APA和單側(cè)腎上腺增生患者首選治療方法是一側(cè)腎上腺切除術(shù)。腹腔鏡下腎上腺切除術(shù)是一種理想的手術(shù)方式，目前已被公認是外科治療腎上腺疾病的金標準。
　　

2、 盡管在臨床實踐中應(yīng)用手術(shù)治療原發(fā)性醛固酮癥增多癥已獲得了良好療效，但長期隨訪發(fā)現(xiàn)部分病人術(shù)后高血壓改善不明顯，仍需服用降壓藥物。文獻報道APA 切除后，其高血壓控制率為33%～87%。原發(fā)性醛固酮癥增多癥，尤其是產(chǎn)醛固酮的腎上腺腺瘤，為何術(shù)后效果不理想？其原因目前尚不明確。多年來大量研究表明高血壓可致血管重構(gòu)：大血管（如主動脈）重構(gòu)導致管壁僵硬度增加、順應(yīng)性減退；小血管重構(gòu)致管腔狹窄引起外周阻力增加，這一現(xiàn)象在原發(fā)性醛固酮增多癥患者同

3、樣存在。據(jù)此有學者認為外周小血管重構(gòu)引起管腔狹窄，血管功能改變所致外周阻力增加參與了原發(fā)性醛固酮癥增多癥術(shù)后持續(xù)性高血壓的發(fā)生。
　　 血管重構(gòu)是指在高血壓過程中與之伴隨的血管結(jié)構(gòu)和功能的改變。主要表現(xiàn)為血管管壁增厚、壁腔比值增高以及隨之產(chǎn)生的血管功能異常。血管壁的增厚，一種表現(xiàn)為內(nèi)膜下間隙和中層細胞總體積和細胞外基質(zhì)增加，中層肥厚并侵犯管腔，此種類型稱為生長（肥厚性重構(gòu)）；另一種是血管體積不變，但組成成分重新排布導致血管內(nèi)外徑

4、縮小、管壁增厚，稱為向心性重構(gòu)，繼發(fā)性高血壓血管重構(gòu)主要表現(xiàn)為前者。
　　 國內(nèi)外大量研究表明，醛固酮對心血管系統(tǒng)是一獨立的致病因子，與原發(fā)性高血壓相比，原發(fā)性醛固酮患者更易發(fā)生心血管重構(gòu)。醛固酮通過參與炎癥反應(yīng)、纖維化、鈣化以及細胞周期的調(diào)控，可不依賴于高血壓而直接引起血管重構(gòu)的發(fā)生。主要表現(xiàn)為血管平滑肌細胞（VSMCs）增生、肥大，細胞外基質(zhì)成分如膠原、纖維粘連蛋白等合成增多，造成管壁增厚，尤其是中層增厚，管腔相對變窄，中層

5、/管腔內(nèi)徑（M/L）比值增加，從而引起外周阻力增加。
　　 醛固酮可刺激血管平滑肌細胞的增殖，在體外實驗已獲得證實，但具體分子機制尚不明確。鼠雙微體-2基因（murine double minute2，MDM2）是一種核蛋白，最初在鼠雙微體中發(fā)現(xiàn)，與p53形成復合體。已知MDM2 參與調(diào)控p53的生物學作用，它可阻止p53介導的細胞凋亡或逆轉(zhuǎn)p53 引起的G1 期停滯，促進細胞進入S 期；此外，MDM2 還被認為可逆轉(zhuǎn)p53 引

6、起的G2 期停滯，促進細胞由G2 期停滯進入M 期；另外，MDM2 還可與RB 蛋白發(fā)生作用，參與血管平滑肌細胞的生長；MDM2 還可被Ras 引發(fā)的Raf/MEK/MAP 激酶通路調(diào)控，該通路不依賴p53作用，從而參與調(diào)節(jié)細胞的生長、凋亡過程，當MDM2 過度表達時，可促進細胞的增殖。最近，Nakamura等報道在體外細胞實驗中，醛固酮經(jīng)其受體（MR）可促進人主動脈平滑肌細胞中MDM2的表達，認為PA 術(shù)后持續(xù)高血壓與MDM2的高表達

7、，參與外周小動脈血管平滑肌細胞增殖，引起血管重構(gòu)有關(guān)。
　　 另外，研究表明醛固酮刺激血管重構(gòu)這一過程中還有多種細胞因子的參與，如內(nèi)皮素-1(ET-1)、表皮生長因子(EGF)、血小板源生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β）等。TGF-β家族是一多功能的多肽類細胞因子，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、遷移以及細胞外基質(zhì)的代謝等過程。其中TGF-β1與心血管的關(guān)系尤為密切，離體和在體的實驗都提示TGF-β1可促進血管平滑肌細胞

8、增殖、遷移，影響各種細胞外基質(zhì)（ECM）成分的代謝過程，如促進膠原蛋白、纖維連接蛋白、蛋白多糖的表達，同時抑制細胞外基質(zhì)降解酶及纖溶酶原激活因子的合成，減少細胞外基質(zhì)的降解，引起ECM 合成和沉積增加，在血管重構(gòu)中發(fā)生重要作用。
　　 本研究首先在大鼠皮下埋置微量滲透泵，持續(xù)泵入醛固酮，建立醛固酮增多癥大鼠模型，觀察外周血管形態(tài)學的變化。進而我們應(yīng)用RT-PCR、Western blotting、免疫組織化學以及天狼星紅染色等方

9、法分別檢測MDM2、p53、TGF-β1 及/ⅠⅢ型膠原基因在大鼠血管平滑肌中的表達有無改變；螺內(nèi)酯是一種鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑，大量研究表明可改善醛固酮對心血管系統(tǒng)的有害效應(yīng)，因此在本研究中我們同時檢測了螺內(nèi)酯對上述基因的表達有無影響。通過本研究我們試圖從分子水平闡明高醛固酮作用下血管重構(gòu)的發(fā)生機制，初步探討原發(fā)性醛固酮癥增多癥患者術(shù)后持續(xù)高血壓的發(fā)生原因及防治措施。
　　 第一部分：醛固酮增多癥大鼠模型的建立
　　 目

10、的：介紹一種建立醛固酮增多癥大鼠模型的方法。
　　 方法：將SD大鼠隨機分為三組，每組8只,分別為模型組、拮抗組及正常對照組。利用微量滲透泵這一給藥系統(tǒng)，將其埋植在大鼠背部皮下建立醛固酮增多癥模型，其中模型組經(jīng)微量滲透泵持續(xù)釋放醛固酮（1 μg/h，4w）；拮抗組除給予等量醛固酮外，每日行螺內(nèi)酯灌胃（100mg/kg/d）；正常對照組僅泵空白溶劑。尾套法檢測大鼠血壓，并測定血鉀、鈉、醛固酮濃度及血漿腎素活性。
　　 結(jié)果

11、：成功建立醛固酮增多癥大鼠模型，模型組大鼠2 周后血壓明顯升高，血鉀下降，呈現(xiàn)低腎素、高醛固酮特征，與對照組和拮抗組相比差異具統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　 結(jié)論：借助微量滲透泵這一載體，可成功建立醛固酮增多癥動物模型，方法簡單，成模率高，為研究原發(fā)性醛固酮增多癥提供了較好的平臺。
　　 第二部分：醛固酮及其受體拮抗劑對大鼠血管平滑肌MDM2 及p53基因表達的影響
　　 目的:觀察醛固酮對大鼠血管平滑肌鼠雙

12、微體-2基因（murine double minute2，MDM2）和p53基因表達的影響。
　　 方法:利用第一部分介紹的方法建立醛固酮增多癥大鼠模型，并將SD大鼠分為三組（每組8只）：正常對照組、醛固酮組及螺內(nèi)酯拮抗組。分別采用RT-PCR、Wester nblotting、免疫組織化學技術(shù)檢測血管平滑肌MDM2 及p53基因表達，應(yīng)用壓力肌動描記器對大鼠腸系膜第三級動脈分支進行形態(tài)學測量。
　　 結(jié)果:與對照組相比

13、，醛固酮組腸系膜小動脈中層增厚，中層/內(nèi)徑比值升高（P＜0.01）；醛固酮組血管平滑肌MDM2 及p53基因表達升高；同時醛固酮組MDM2/p53表達比值亦明顯高于對照組（P＜0.01）。螺內(nèi)酯可抑制醛固酮的上述作用（P＜0.01）。
　　 結(jié)論:醛固酮可促進血管平滑肌細胞中MDM2的表達，后者可能通過促進血管平滑肌細胞的增殖參與血管重構(gòu)的發(fā)生；p53表達上調(diào)可能是血管平滑肌細胞對高醛固酮刺激產(chǎn)生的一種保護性反應(yīng)。螺內(nèi)酯可拮抗醛

14、固酮的效應(yīng)，改善外周血管重構(gòu)。
　　 第三部分：醛固酮及其受體拮抗劑對大鼠血管平滑肌TGF-β1、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原表達的影響
　　 目的:觀察醛固酮及其受體拮抗劑對大鼠血管平滑肌TGF-β1、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原表達的影響，初步探討原發(fā)性醛固酮增多癥發(fā)生血管重構(gòu)的可能機制。
　　 方法:利用第一部分介紹的方法建立醛固酮增多癥大鼠模型，并將SD大鼠分為三組：
　　 正常對照組、醛固酮組及螺內(nèi)酯拮抗組，每組8

15、只。光鏡下觀察大鼠主動脈形態(tài)學變化并檢測血管中層厚度及橫截面積、血管內(nèi)徑；腸系膜小動脈形態(tài)學測量方法見第二部分。分別采用RT-PCR、Western blotting 及免疫組織化學方法檢測血管平滑肌TGF-β1的表達；應(yīng)用RT-PCR檢測Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原mRNA 水平的表達；苦味酸-天狼星紅染色偏振光下檢測大鼠主動脈及腸系膜小動脈中Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的含量。
　　 結(jié)果:⑴血管形態(tài)學測量：醛固酮組與其他兩組相比，主動脈血管中

16、層厚度及M/L比值無統(tǒng)計學差異；而腸系膜動脈血管中層厚度及M/L 比值增加，管腔內(nèi)徑變小，差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；⑵醛固酮組主動脈平滑肌TGF-β1基因在mRNA 及蛋白表達均明顯高于其他兩組（P＜0.01）；⑶與其他兩組相比，醛固酮組主動脈平滑?、裥图阿笮湍z原在轉(zhuǎn)錄水平表達均升高，而在翻譯水平僅Ⅲ型膠原表達升高，血管中層總膠原和Ⅰ型膠原含量則無明顯變化；⑷腸系膜動脈血管壁總膠原、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原含量醛固酮組明顯高于其他兩組