高表達(dá)hRAMP1基因腺病毒載體的構(gòu)建及其在兔MSCs中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建重組腺病毒載體pAdxsi-EGFP-hRAMP1，轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），觀察其轉(zhuǎn)染率及hRAMP1的mRNA及蛋白表達(dá)。
　　 方法：質(zhì)粒pOTB7-hRAMP1用EcoRI+XhoI雙酶切后回收hRAMP1片段，亞克隆至pShuttle-EGFP-CMV中，得到重組穿梭質(zhì)粒；I-CeuI+I-SceI雙酶切處理pShuttle-EGFP-CMV-hRAMP1，回收EGFP-CMV-EGFP-hRAM

2、P1片段，亞克隆至腺病毒骨架載體pAdxsi，得到重組腺病毒質(zhì)粒；重組腺病毒質(zhì)粒酶切線性化后應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，觀察細(xì)胞出毒跡象并進(jìn)行包裝、收毒、凍融、擴(kuò)增、再收毒并作毒種鑒定后以離心，透析方法純化腺病毒進(jìn)行滴度測(cè)定及檢測(cè)。提取新鮮骨髓，體外分離、培養(yǎng)并鑒定MSCs。將帶有hRAMP1和EGFP基因的腺病毒載體，感染第3代MSCs，熒光倒置顯微鏡下計(jì)算感染率。收集病毒感染后的MSCs行RT-PCR檢測(cè)表明存在hRAMP1基因的m

3、RNA表達(dá)，WesternBlot亦證實(shí)hRAMP1基因的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：構(gòu)建的重組穿梭質(zhì)pShuttle-EGFP-CMV-hRAMP1用EcoRI+XhoI雙酶切，得到大小為0.8kbp（hRAMP1）和5.1kbp（pShuttle-EGFP-CMV）兩個(gè)片段；重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-EGFP-CMV-hRAMP1用XhoI酶切得到7個(gè)片段，而作為對(duì)照的空腺病毒質(zhì)粒只得到6個(gè)片段；重組腺病毒質(zhì)粒在293細(xì)胞中包

4、裝后產(chǎn)生的重組腺病毒對(duì)293細(xì)胞有致病作用；重組腺病毒Ad-EGFP-hRAMP1 PCR鑒定可見(jiàn)164bp的陽(yáng)性擴(kuò)增條帶；經(jīng)多次重復(fù)感染后，病毒滴度檢測(cè)達(dá)2.5×1011PFU/ml。成功轉(zhuǎn)染Ad-EGFP-hRAMP1的兔MSCs可表達(dá)綠色熒光，當(dāng)MOI值為800，轉(zhuǎn)染效率為80％。RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的MSCs有hRAMP1基因mRNA表達(dá)；Wester-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的MSCs有hRAMP1蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：