TCRαβ+CD4-CD8-T細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的致病作用及作用機制研究.pdf

1、研究背景:
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以大量自身抗體形成為特征的慢性自身免疫性疾病，該病臨床表現(xiàn)復雜，累及全身各大系統(tǒng)，病程遷延，嚴重危害人類健康。SLE的病因較為復雜，發(fā)病機制至今尚未完全明了，細胞免疫調(diào)節(jié)異常是發(fā)病機制中的主要環(huán)節(jié)，尤其是淋巴細胞的活化以及一系列炎癥細胞因子的產(chǎn)生均可導致補體激活、免疫復合物的沉積和靶器官的細胞浸潤，在SLE的發(fā)病中起著重要作

2、用。
　　 調(diào)節(jié)性T細胞是機體維持自身免疫耐受和調(diào)節(jié)各種免疫應(yīng)答的重要細胞，在SLE以及類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)等自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。調(diào)節(jié)性T細胞具有多種表型，其中，TCRαβ+CD4-CD8-即雙陰性T細胞(Double negative T cells，DNT細胞)是一類新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細胞，正常情況下，DNT細胞在外周血淋巴細胞中的比例僅占1％左右。國外有研究顯示

3、DNT細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中顯著增加，并且增加的DNT細胞具有炎癥細胞的表型，在疾病的發(fā)病機制中起著重要作用。臺灣學者發(fā)現(xiàn)在中國的SLE患者外周血中DNT細胞也有升高的趨勢，但與正常對照者相比差異無統(tǒng)計學意義。我們前期通過小樣本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血中DNT細胞顯著增加，并與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。因此，在本研究中我們將通過進一步擴大樣本量來加以證實，并尋找SLE患者DNT細胞與疾病發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān)性。
　　 SLE患者

4、中DNT細胞增加的機制目前尚不清楚。Fas途徑是體內(nèi)維持T細胞平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，在維持DNT細胞在組織中的正確分布起著重要的作用。細胞表面Fas受體的表達率降低會導致該細胞對Fas介導的凋亡敏感性降低，從而逃逸Fas-FasL途徑介導的凋亡。SLE患者中升高的DNT細胞是否是由于其表面Fas受體的表達率降低所致，以及DNT細胞表面Fas受體的表達是否與疾病活動性有關(guān)，目前尚未見相關(guān)報道。
　　 有關(guān)DNT細胞功能，目前研究較多的

5、是DNT細胞的免疫抑制作用。然而，研究者發(fā)現(xiàn)在SLE患者中增加的DNT細胞可通過與B淋巴細胞的相互作用促進自身抗體的產(chǎn)生，在狼瘡腎炎的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。此外，在狼瘡小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)DNT細胞顯著增加，分泌大量的IL-17，并且與疾病的嚴重性呈顯著地正相關(guān)關(guān)系。白細胞介素-17(Interleukine-17，IL-17)是由活化的T淋巴細胞產(chǎn)生的炎性細胞因子。研究證實IL-17在慢性炎癥時可導致組織損傷，在SLE的炎癥反應(yīng)中扮演著重

6、要角色。目前為止，國外僅有一篇文獻報道SLE患者外周血中的DNT細胞可以分泌細胞因子IL-17，并在腎組織的活檢標本中證實有DNT細胞與IL-17的沉積，并認為DNT細胞及其分泌的細胞因子IL-17在狼瘡腎炎的發(fā)病中起重要作用，國內(nèi)尚無相關(guān)文獻報道。
　　 研究目的:
　　 目前，雖然對SLE的研究眾多，但是SLE的發(fā)病機制仍然沒有闡明，SLE中DNT細胞增加的原因仍不清楚，有關(guān)SLE患者中DNT細胞功能方面的研究甚少，

7、因此深入了解DNT細胞在SLE中的作用及作用機制對SLE發(fā)病機理的研究具有重要意義。本課題結(jié)合國內(nèi)外研究進展和我們前期的工作，分別以SLE患者、RA患者以及正常對照者為研究對象，觀察各研究對象中DNT細胞數(shù)量的變化及其表面Fas受體表達的情況，探討DNT細胞與Fas介導的凋亡敏感性的關(guān)系，從而探討SLE患者中DNT細胞增加的原因及其與疾病的相關(guān)性;通過檢測SLE患者和正常對照者外周血各T細胞亞群在不同條件刺激下細胞因子IL-17的分泌情

8、況，證實DNT細胞在SLE患者炎癥反應(yīng)中的作用及作用機制，為SLE的發(fā)病機制的研究提供新的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，從而為SLE的診斷和治療開辟新的思路。
　　 研究方法:
　　 1、研究對象
　　 病例組:隨機選擇2011年5月至2012年1月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院確診為SLE的56例患者作為病例組，其中男性3例，女性53例，平均年齡為28.07±10.84歲。所有納入的患者均符合美國風濕病學會(ACR)1997年推薦

9、的SLE的分類標準，并除外感染、原發(fā)性心、肝、腎等器質(zhì)性病變以及合并其他自身免疫病史等。采用系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)評分(Systemic lupus erythematosusdisease activity index，SLEDAI)對患者進行疾病活動性評估，根據(jù)0～4分為基本無活動，5～9分為輕度活動，10～14分為中度活動，≧15分為重度活動，結(jié)合我們的研究目的，將評分＜10分定義為緩解期，≧10分定義為活動期。
　　

10、 1.1、疾病對照組:根據(jù)美國風濕病學會(ACR)1987年修訂的RA的分類標準，選取同期南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院確診為RA的25例患者作為疾病對照組，其中男性2例，女性23例，平均年齡為32.56±4.22歲。除外感染、原發(fā)性心、肝、腎等器質(zhì)性病變以及合并其他自身免疫病史等。
　　 1.2、正常對照組:隨機選取同期南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院27例健康查體者作為正常對照組，平均年齡32.37±10.02歲，其中男性2例，女性25例，均排除

11、感染、原發(fā)性的心、肝、腎等器質(zhì)性病變以及自身免疫病史等。三組年齡、性別之間均無顯著性差異。
　　 2、研究方法
　　 2.1、采用多色流式細胞術(shù)分別檢測56例SLE患者、25例RA患者以及27例正常對照者外周血DNT細胞的比例以及其表面Fas受體的表達情況
　　 將用于標記的熒光抗體和相應(yīng)的同型對照分別置于流式管底部，分別加入適量全血，輕輕混勻，避光孵育、溶血、洗滌細胞后，PBS重懸細胞，采用BDFACS-Cal

12、ibur流式細胞儀進行檢測，計數(shù)至少10萬個細胞，以FSC/SSC二維散射光設(shè)門圈定淋巴細胞群，利用BD公司Cell Quest軟件進行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，檢測外周血中DNT細胞以及表面Fas受體的表達情況。
　　 2.2、采用多色流式細胞術(shù)分別檢測13例SLE患者以及7例正常對照者全血中各T淋巴細胞亞群胞內(nèi)的細胞因子IL-17的表達情況
　　 取適量肝素鈉抗凝全血，加入RPMI1640全培，混勻后加入佛波酯(Phorb

13、olmyristate acetate，PMA)、鈣離子導入劑(Ionomycin)聯(lián)合刺激以及布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)進行阻斷，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5個小時后收集細胞，離心后去上清，混勻，進行表面染色、固定、破膜和胞內(nèi)染色。采用BD FACS-Calibur流式細胞儀檢測全血中各淋巴細胞亞群的比例以及其胞內(nèi)細胞因子IL-17的表達。
　　 2.3、采用多色流式細胞術(shù)分別檢測13例SLE患者以

14、及7例正常對照者分離的外周血單個核細胞在有或無anti-CD3刺激培養(yǎng)5天后各T淋巴細胞亞群胞內(nèi)細胞因子IL-17的表達情況
　　 采用梯度密度離心法分離外周血單個核細胞，調(diào)整細胞濃度后接種到預先包被好anti-CD3的12孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。在收集細胞前的5個小時加入PMA、Ionomycin以及BFA阻斷劑培養(yǎng)刺激，收集細胞，離心去上清，混勻后進行表面染色、固定、破膜和胞內(nèi)染色。采用BDFAC

15、S-Calibur流式細胞儀分別檢測在有或無anti-CD3刺激培養(yǎng)5天后外周血單個核細胞中各T淋巴細胞亞群比例以及胞內(nèi)細胞因子IL-17的表達情況。
　　 3、統(tǒng)計方法
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析。所有計量資料均采用(x)±s表示，數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗不滿足正態(tài)性和（或）方差齊性，兩獨立樣本均數(shù)比較采用Mann-WhitneyU檢驗，兩配對樣本比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗，相關(guān)性采用spearman相關(guān)

16、以及偏相關(guān)進行分析，多個獨立樣本比較采用Kruskal-WallisH檢驗，其中兩兩比較用Bonferroni法。取α=0.05為檢驗標準，Bonferroni法以調(diào)整后的α'=0.05/3=0.017為檢驗標準。
　　 結(jié)果:
　　 1、SLE患者外周血中DNT細胞的比例及其與疾病活動性的相關(guān)性
　　 1.1、外周血DNT細胞占TCRαβ+細胞比例的比較中，SLE、RA、NC三組總體比較有顯著性差異(P＜0.0

17、01)。其中，SLE組DNT細胞的比例顯著高于正常對照組(2.45±1.45 vs.1.08±0.62，P＜0.001);與RA組比較，SLE組DNT細胞的比例顯著增高(2.45±1.45 vs.1.57±0.98，P=0.002)，RA組與NC組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 1.2、SLE患者外周血中的DNT細胞與疾病活動的相關(guān)性分析顯示，初發(fā)患者的DNT細胞高于復查患者;活動期SLE患者外周血DNT細胞顯著高于緩解期患

18、者;SLE患者中補體降低組的DNT細胞比例顯著高于補體正常組。SLE患者外周血DNT細胞與自身抗體的水平之間無顯著相關(guān)性，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)(SLEDAI)之間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.376，P=0.005)。
　　 2、SLE患者外周血DNT細胞表面Fas受體的表達與疾病活動性的相關(guān)性
　　 2.1、外周血DNT細胞表面Fas受體表達的比較中，SLE、RA、NC三組總體比較具有顯著性差異(P=0.015)，其中

19、，SLE組與正常對照組相比，SLE組外周血DNT細胞表面Fas受體的表達顯著增加(1.44±0.91 vs.0.91±0.55，P=0.004)，SLE組與RA組相比，差異無統(tǒng)計學意義;RA組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 2.2、外周血DNT細胞表面Fas受體表達率的比較中，SLE、RA、NC三組總體比較具有顯著性差異(P＜0.001)。其中，SLE組與正常對照組相比，SLE組DNT細胞表面Fas表達率顯著降低(6

20、1.39±19.20vs.75.95±8.88，P＜0.001);SLE組與RA組相比，SLE組DNT細胞表面的Fas表達率也顯著降低(61.39±19.20 vs.74.11±12.82，P=0.004)。RA組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 2.3、SLE患者DNT細胞表面Fas受體的表達與患者疾病活動性的關(guān)系分析中，SLE患者DNT細胞表面Fas受體的表達與DNT細胞的比例呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.796，P＜

21、0.001);SLE患者中補體降低組的DNT細胞表面Fas受體表達顯著高于補體正常組;SLE患者DNT細胞表面Fas受體的表達與疾病活動指數(shù)(SLEDAI)之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.332，P=0.014）。SLE患者DNT細胞表面Fas受體表達率與抗雙鏈DNA抗體以及抗核抗體水平之間均存在負相關(guān)關(guān)系，但與SLEDAI相關(guān)性不顯著。
　　 3、不同刺激下，各T細胞亞群的比例及其分泌IL-17比例及SLE患者中DNT細胞分泌

22、的IL-17與疾病活動性的相關(guān)性
　　 3.1、經(jīng)過5小時培養(yǎng)刺激后，SLE患者全血中的總T細胞（TCRαβ+細胞）比例與正常對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義，TCRαβ+細胞分泌的IL-17顯著高于正常對照組（1.22±0.74 vs.0.42±0.29，P=0.030）;CD4+CD8-細胞比例顯著低于對照組(37.22±7.02 vs.45.80±6.99，P=0.019)。CD4+CD8-細胞分泌的IL-17與正常對照組之間

23、的差異無統(tǒng)計學意義;CD8+CD4-細胞比例及其分泌的IL-17與正常對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義;DNT細胞的比例顯著高于正常對照組(4.76±1.15 vs.1.80±0.62，P＜0.001)，DNT細胞分泌的IL-17顯著高于正常對照組（0.42±0.31 vs.0.03±0.02，P＜0.001）。
　　 3.2、經(jīng)過5天無anti-CD3刺激培養(yǎng)后，SLE患者的TCRαβ+細胞、CD4+CD8-細胞以及CD8+CD4

24、-細胞比例與正常對照組之間均差異無統(tǒng)計學意義;DNT細胞比例顯著高于正常對照組（7.83±1.71 vs.1.97±0.88，P＜0.001）。SLE患者外周血單個核細胞中的以上四種細胞分泌的IL-17均顯著高于正常對照組(P均＜0.05)。
　　 3.3、經(jīng)過5天有anti-CD3刺激培養(yǎng)后，SLE患者的TCRαβ+細胞以及CD8+CD4-細胞與正常對照組相似，CD4+CD8-細胞比例低于正常對照組（44.11±9.21 vs

25、.57.14±9.97，P=0.014）;DNT細胞比例顯著高于對照組（16.94±4.43 vs.5.74±2.35，P＜0.001）。SLE患者TCRαβ+細胞分泌的IL-17顯著高于正常對照組（0.73±0.22 vs.0.42±0.18，P=0.008）;CD4+CD8-細胞以及CD8+CD4-細胞分泌的IL-17與正常對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義;DNT細胞分泌的IL-17顯著高于正常對照組（1.50±0.90 vs.0.64

26、±0.50，P=0.024）。
　　 3.4、SLE患者在有或無anti-CD3刺激的比較中，有anti-CD3刺激組的CD4+CD8-細胞比例低于無刺激組（44.11±9.21 vs.48.50±13.03，P=0.028），有anti-CD3刺激組的DNT細胞比例顯著高于無刺激組（16.94±4.4 vs.37.83±1.71，P=0.001）。有刺激組的CD4+CD8-細胞分泌的IL-17低于無刺激組（0.46±0.17v

27、s.0.68±0.31，P=0.028），有anti-CD3刺激的DNT細胞分泌的IL-17顯著高于無刺激組（1.50±0.90 vs.0.67±0.40，P=0.002）。
　　 3.5、在anti-CD3刺激培養(yǎng)5天的條件下，SLE患者DNT細胞分泌的IL-17與疾病活動性的相關(guān)性分析中，補體降低組的DNT細胞分泌的IL-17顯著高于補體正常組，活動期患者的DNT細胞分泌的IL-17顯著高于緩解期患者。SLE患者DNT細胞分

28、泌的IL-17與抗雙鏈DNA抗體以及抗核抗體的水平之間無顯著相關(guān)性，與SLEDAI之間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.573，P=0.041)。
　　 結(jié)論:
　　 1、SLE患者外周血DNT細胞比例顯著高于RA患者以及正常對照者，活動期SLE患者的DNT細胞顯著高于緩解期患者，且DNT細胞的比例與疾病活動指數(shù)之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，表明DNT細胞的升高與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，DNT細胞可能參與了SLE的發(fā)病。
　　

29、2、SLE患者外周血DNT細胞表面的Fas表達率顯著低于RA患者以及正常對照者，表明DNT細胞對Fas介導的凋亡敏感性降低，可能是DNT細胞增加的原因之一。DNT細胞表面Fas受體的表達顯著高于正常對照者，并與疾病活動密切相關(guān)，表明DNT細胞表面Fas受體的表達在一定程度上可以反映SLE患者疾病的活動性。
　　 3、SLE患者DNT細胞分泌的IL-17顯著高于正常對照組，在anti-CD3刺激后，DNT細胞能迅速增殖，產(chǎn)生大量I